甜菜碱对大肠杆菌K88的抑菌效果研究

■曲恒漫 文 媛 王佳荣 周岩民 温 超

（南京农业大学动物科技学院，江苏南京 210095）

甜菜碱是一种季铵型水溶性生物碱，化学名称为三甲基甘氨酸。甜菜碱广泛分布于动物、植物和微生物机体中，主要生理功能是提供活性甲基，为肉碱、肌酸、嘌呤及蛋氨酸等多种物质的合成提供原料，参与氨基酸、蛋白质、脂肪的代谢[1]。在饲料中添加甜菜碱具有促进动物生长、调节渗透压、改善胴体组成、提高肉质等作用，对水生动物具有诱食作用[2-5]。近年来的研究表明，甜菜碱对几种人类临床常见致病菌具有一定的抑菌作用[6-7]，但对动物体内常见致病菌是否有抑菌效果尚未见报道。为此，本试验以饲料中常用的无水甜菜碱及甜菜碱盐酸盐为试验材料，以对仔猪危害较大的大肠杆菌K88为研究对象，分析两种甜菜碱产品的体外抑菌活性，旨在为甜菜碱在饲料中的应用研究提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

试验用无水甜菜碱和甜菜碱盐酸盐由宜兴市天石饲料有限公司提供，纯度分别为96%、97%。大肠杆菌K88购于国家兽医微生物菌种保藏中心。

1.2 菌种的活化

将-20℃保存的大肠杆菌K88解冻后接种到LB液体培养基中，37℃、160 r/min振荡培养12 h后，再次接种到新鲜LB培养基中，培养3 h进入对数期，备用[7]。

1.3 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度

吸取1 ml培养到对数期的大肠杆菌K88菌液加入10 ml含无水甜菜碱或甜菜碱盐酸盐浓度均分别为800、400、200、100、50、25、12.5、6.25、3.125、1.56 mg/ml的LB培养基中，同时设置只加菌液和只加无水甜菜碱或甜菜碱盐酸盐的对照管，37℃、200 r/min恒温振荡培养24 h后观察结果。取未见细菌生长的上清液100 μl涂布到琼脂平板，37℃培养18 h后计数，观察琼脂平板菌落生长状况，并根据试验结果调整甜菜碱浓度，菌落个数少于5个的平板所对应的最小甜菜碱浓度为MIC，无细菌生长的平板所对应的最小甜菜碱浓度为最小杀菌浓度（MBC）。试验重复3次[1]。

1.4 不同培养时间对无水甜菜碱或甜菜碱盐酸盐抑菌效果的影响

在10 ml高压灭菌生理盐水中加入一定质量的无水甜菜碱或甜菜碱盐酸盐配制成MIC或MBC的溶液，加入100 μl培养到对数生长期的细菌菌液，37℃、200 r/min振荡培养，同时设置一个细菌的纯培养作为空白对照。分别培养0、0.5、1、2、4、8、16、24 h后取出，菌液梯度稀释后，取适宜稀释度的菌液涂布于琼脂平板，37℃培养18 h后计数，计算抑菌率，绘制曲线图。试验重复3次。

1.5 不同浓度的无水甜菜碱或甜菜碱盐酸盐对大肠杆菌K88抑菌效果的影响

在10 ml高压灭菌生理盐水中加入不同质量的无水甜菜碱或甜菜碱盐酸盐配制成 4、5、6、7、8、9、15 mg/ml的溶液，移取100 μl培养到对数生长期的细菌菌液加入其中，37℃、200 r/min振荡培养，同时设置一个细菌的纯培养作为空白对照。培养24 h后取出，菌液梯度稀释后，取适宜稀释度的菌液涂布于琼脂平板，37℃培养18 h后计数，计算抑菌率，绘制曲线图。试验重复3次。

2 结果与分析

2.1 最小抑菌浓度和最小杀菌浓度（见表1）

表1 不同浓度无水甜菜碱及甜菜碱盐酸盐对大肠杆菌K88的抑菌效果

如表1所示，当无水甜菜碱浓度提高到800 mg/ml时仍可见大量细菌生长，说明无水甜菜碱对大肠杆菌K88的抑菌效果不明显。甜菜碱盐酸盐的最小抑菌浓 度 (MIC)为 6.25 mg/ml，最 小 杀 菌 浓 度(MBC)为8.125 mg/ml。

2.2 不同培养时间对甜菜碱盐酸盐抑菌效果的影响（见图1）

如图1所示，在甜菜碱盐酸盐浓度为6.25 mg/ml时，随培养时间的延长，抑菌率逐渐增加，当抑菌时间达到16 h时，抑菌率超过50%，可见该浓度甜菜碱盐酸盐在16 h以后才会达到明显的抑菌效果；在甜菜碱盐酸盐浓度为8.125 mg/ml时，抑菌率随时间延长迅速提高，24 h后抑菌率达到90%，可见甜菜碱盐酸盐浓度达到8.125 mg/ml时具有抑菌和杀菌作用。

图1 甜菜碱盐酸盐在不同培养时间对大肠杆菌K88的抑菌率

2.3 不同浓度甜菜碱盐酸盐对大肠杆菌K88抑菌效果的影响（见图2）

由图2可以看出，随着甜菜碱盐酸盐浓度增大，抑菌率逐渐增加，当浓度达到7 mg/ml时，抑菌率超过50%，达到抑菌效果，当浓度达到9 mg/ml时，抑菌率超过90%，达到杀菌效果。

图2 不同浓度甜菜碱盐酸盐对大肠杆菌K88的抑菌率

3 讨论

近年来，部分文献报道了甜菜碱的体外抑菌作用，如张爱君等[6]发现甜菜碱对大肠杆菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和白色念珠菌均有明显的抑制作用。黄忠民等[8]亦发现甜菜碱对金黄色葡萄球菌有显著的抑制作用，并推测可能的抑菌机制是：甜菜碱作为一种带正电荷的季铵盐类化合物，容易吸附于带负电荷的金黄色葡萄球菌表面并穿透其细胞壁，作用于细胞膜和酶体系，抑制其呼吸作用，进一步使细菌外膜裂解，新陈代谢被抑制而死亡。但上述文献中均未说明所用甜菜碱剂型。为此，本试验比较了无水甜菜碱和甜菜碱盐酸盐大肠杆菌K88的体外抑菌作用，结果发现无水甜菜碱对大肠杆菌K88抑菌效果并不明显，抑菌效果远远弱于甜菜碱盐酸盐，其原因可能为：无水甜菜碱呈中性，而甜菜碱盐酸盐呈强酸性，添加甜菜碱盐酸盐后使培养基pH值降低，从而使大肠杆菌K88细胞内外的的蛋白质变性，细胞膜和酶失去生物活性，生命活动无法进行而导致死亡。甜菜碱盐酸盐大肠杆菌K88的MIC为6.25 mg/ml，与张爱君等[6]的研究结果一致。本试验还发现，当甜菜碱盐酸盐浓度提高或培养时间延长时，抑菌率随之提高，说明其抑菌效果呈剂量和时间依赖性。

4 结论

无水甜菜碱对大肠杆菌K88抑菌效果不明显，而甜菜碱盐酸盐有一定抑菌作用，最小抑菌浓度为6.25 mg/ml，最小杀菌浓度为8.125 mg/ml。随着甜菜碱盐酸盐浓度提高或培养时间延长，抑菌率提高。