咖啡及咖啡制品中葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因含量比较分析

邵金良，刘兴勇，杨东顺，樊建麟，杜丽娟，王丽，汪禄样

（云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明650223）

咖啡及咖啡制品中葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因含量比较分析

邵金良，刘兴勇，杨东顺，樊建麟，杜丽娟，王丽，汪禄样

（云南省农业科学院质量标准与检测技术研究所，云南昆明650223）

建立了高效液相色谱，同时测定生咖啡豆、烘炒咖啡豆和咖啡粉等样品中葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因含量的方法，同时采用SPSS主成分分析和聚类分析法对咖啡及咖啡制品中的葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因等品质指标进行比较分析。样品经甲醇-0.10%磷酸（50∶50）溶液超声提取后，过PTFE滤膜后在ShiseidoCAPCELLPAKMGⅡC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm），以甲醇-0.10%磷酸（12∶88）溶液为流动相进行等度洗脱，检测波长分别为254，320 nm。结果表明，葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因在0.05～50.00 mg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数（r）为0.999 5～0.999 8，检出限（LOD）为0.28～0.41 mg/L，定量限（LOQ）为0.81～1.16 mg/L；葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因的回收率分别为81.75%～117.2%，85.36%～112.4%和83.74%～110.9%，相对标准偏差（RSD）分别为4.06%～9.94%，3.68%～11.2%和2.87%～8.59%。主成分分析结果表明，葫芦巴碱、咖啡因和绿原酸是咖啡及咖啡制品的特征品质指标，绿原酸和咖啡因为第1主成分，贡献率达到64.932%；葫芦巴碱为第2主成分，贡献率为34.944%，2个主成分累计贡献率为99.876%。以葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因含量为指标，采用聚类分析对咖啡及咖啡制品样品进行分类，可将咖啡及咖啡制品分为两大类，聚类分析结果表明，云南不同咖啡产品中葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因含量具有一定的差异，可为云南咖啡产业的发展提供科学数据和参考。

咖啡及咖啡制品；葫芦巴碱；绿原酸；咖啡因；比较分析

咖啡（coffea spp.）是茜草科（Rubiaceae）咖啡属（coffea）常绿灌木或小乔木，与茶叶、可可并称为世界三大饮料，其消费量是可可的2倍，是茶叶的3倍。近年来，咖啡产业在我国发展比较迅速，产业规模不断扩大，已成为独具优势的特色产业[1-2]。葫芦巴碱为尼克酸甲基化的产物，是植物体内的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADP）代谢或转化而产生的，具有降血糖、抗肿瘤等功效，其含量与咖啡品种、生长环境和加工工艺有关[3-4]。绿原酸为咖啡酸与奎尼酸形成的酯，是咖啡中独特的次生代谢产物，具有抗氧化、抗肿瘤、保肝利胆、清除自由基等功效[5-6]。咖啡因是存在于许多天然植物（如茶叶、咖啡豆、可可豆等）中的一类属于甲基黄嘌呤的生物碱，是一种中枢神经兴奋剂，对心脑血管系统、消化系统、肿瘤化疗的生化调节、神经官能症和偏头痛等均有积极作用[7-8]，呈典型的苦味，是咖啡中较为重要的风味物质[9]。咖啡豆经过烘焙，绿原酸、葫芦巴碱、多糖、脂肪和蛋白质等发生不同程度的美拉德、Strecker降解、焦糖化等化学反应，生成吡嗪类、呋喃类、吡咯类、吡喃类和吡啶类化合物，还有大量的醛类、酮类、酚类、酯类、醇类化合物，这些复杂的化合物形成了咖啡的特征风味[10-12]。有关葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因等化合物的分析国内外均有报道，检测方法主要有高效液相色谱法[13]、毛细管电泳-电化学检测法[14]、液相色谱-质谱法[15]和分光光度法[16]等，但是采用高效液相色谱法同时测定咖啡及其制品中葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因含量的研究报道较少。

云南具有低纬度、高海拔、昼夜温差大等独特的气候和多变的高原立体地理环境，特别适合小粒咖啡的生长，种植的咖啡具有口味层次多样化等优点，是全国最大的咖啡生产和出口基地[17-20]。受气候和土壤等环境因素的影响，不同产地的咖啡其葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因含量存在一定的差异。

本研究收集云南本地46份生咖啡豆、烘焙咖啡豆半成品和速溶咖啡喷干粉等样品，通过优化色谱分离条件，建立高效液相色谱法，同时测定并进一步比较云南不同咖啡产品葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因等重点品质指标的含量差异性，以期为云南咖啡产业的发展提供科学参考和借鉴。

1 材料和方法

1.1 材料与试剂

所用试验材料均于2014年6月至2015年7月在云南本地超市和农贸市场购买，生咖啡豆和烘焙咖啡豆粉碎后过0.297 mm筛，备用。

甲醇（色谱纯）：德国Merck公司产品；水为娃哈哈饮用纯净水：杭州娃哈哈集团有限公司产品；葫芦巴碱、绿原酸、咖啡因对照品（经HPLC峰面积归一化法测定，纯度质量分数大于98%）：成都曼思特生物科技有限公司产品。

1.2 仪器与设备

Waters e2695高效液相色谱仪（在线脱气机，四元泵，自动进样器，柱温箱，2998二极管阵列检测器，Empower 2色谱数据工作站）：美国Waters公司产品；JJ200电子分析天平：江苏省常熟市双杰测试仪器厂产品；KQ500-E型超声清洗器：江苏昆山市超声仪器有限公司产品。

1.3 方法

1.3.1 样品前处理精密称取0.50 g咖啡样品，置于250 mL具塞锥形瓶中，加入20 mL甲醇-0.10%磷酸水溶液（50∶50），室温下超声波（功率200 W，频率40 kHz）提取10 min，静置，放冷，转移定容于50 mL容量瓶中；继续加入20 mL甲醇-0.10%磷酸水溶液（12∶88）到250 mL具塞锥形瓶中，室温下超声（功率200 W，频率40 kHz）提取10 min，静置，放冷，合并滤液到50 mL容量瓶中，用甲醇-0.10%磷酸水溶液（50∶50）定容，过0.45 μm滤膜备用。

1.3.2 标准溶液的配制分别准确称取葫芦巴碱、绿原酸、咖啡因的对照品100 mg，分别用甲醇溶解并定容至10 mL容量瓶中，摇匀，得到单一对照品溶液；然后分别量取上述对照品溶液1 mL于10 mL容量瓶中，并用甲醇定容，得到葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因质量浓度为1 000 mg/L的混合对照品溶液，4℃储存，备用。

1.3.3 液相色谱条件Shiseido CAPCELL PAK MGⅡC18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5.0 μm），流动相选用甲醇-0.10%磷酸（12∶88），流速1.00 mL/min，检测波长：葫芦巴碱和咖啡因254 nm、绿原酸320 nm，柱温35.0℃，进样量10.0 μL。

1.3.4 高效液相色谱检测方法的建立

1.3.4.1 线性方程配制葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因混合标准溶液质量浓度为0.05，0.10，0.50，1.0，2.0，5.0，10.0，50.0 mg/L系列标准工作液按照1.3.3方法进行进样测定，以葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因的峰面积A（mAU）为纵坐标，葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因的浓度C（mg/L）为横坐标绘制标准曲线。检出限（LOD）为3倍的信噪比，定量限（LOQ）为10倍的信噪比[21]。

1.3.4.2 准确度和精密度[22]准确度：分别以生咖啡豆、烘焙咖啡豆和速溶咖啡粉样品作为空白基质，添加已知质量浓度的葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因混合标准溶液，按照1.3.3方法测定，采用外标法计算回收率。

精密度：分别以生咖啡豆、烘焙咖啡豆和速溶咖啡粉样品作为空白基质，根据待测样品目标化合物的含量，添加低、中、高质量浓度的葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因混合标准溶液，按照1.3.3方法测定，连续进样5次，考察葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因加标回收的相对标准偏差（RSD）。

1.4 数据分析

试验数据采用Microsoft office excel 2007计算平均值和相对标准偏差（RSD），采用SPSS17.0统计软件对咖啡及咖啡制品葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因测定数据进行方差分析、聚类分析和主成分分析[23]。

2 结果与分析

2.1 高效液相色谱条件的优化和建立

2.1.1 液相色谱流动相的优化取配制好的含有葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因的混合对照品溶液，按1.3.1处理，选择Shiseido CAPCELL PAK MGⅡC18色谱柱作为分离柱，以甲醇-0.10%磷酸溶液为流动相。结果表明，增加流动相中甲醇的比例可以加快分离，但葫芦巴碱出峰时间过早，不利于色谱分离；降低流动相中甲醇的比例可以使分离度变大，但分离时间延长，峰形易变宽。兼顾分离速度和效果的基础上，确定甲醇-0.10%磷酸（12∶88）为流动相，流速为1.0 mL/min时，分离效果较好（图1，2）。

2.1.2 线性范围、检出限和定量限葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因在0.05～50.0 mg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数（r）为0.999 5～0.999 8，检出限（LOD）为0.28～0.41 mg/L，定量限（LOQ）为0.81～1.16 mg/L（表1）。

表1 3种化合物的线性范围、线性方程、相关系数、检出限和定量限

2.1.3 准确度与精密度方法的回收率和精密度（n＝5）如表2所示。

表2 方法的回收率和精密度（n＝5）

从表2可以看出，生咖啡豆、烘焙咖啡豆和速溶咖啡粉样品等3种供试样品，葫芦巴碱的回收率为81.75%～117.20%，相对标准偏差（RSD）为4.06%～9.94%；绿原酸的回收率为85.36%～112.40%，相对标准偏差（RSD）为3.68%～11.20%；咖啡因的回收率为83.74%～110.90%，相对标准偏差（RSD）为2.87%～8.59%。

2.2 供试样品葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因含量的分析测定

由表3，4可知，咖啡及其咖啡制品中均含有葫芦巴碱、咖啡因和绿原酸等3种化合物，且不同样品同一化合物其质量分数差异显著（P＜0.05）。咖啡及咖啡制品葫芦巴碱含量为0.09%～1.41%，其含量平均值大小为生咖啡豆＞速溶咖啡冷冻粉＞速溶咖啡喷干粉＞速溶咖啡喷雾粉＞速溶咖啡凝聚粉＞焙炒咖啡豆=速溶咖啡冻干粉；绿原酸含量为0.32%～6.24%，其含量平均值大小为生咖啡豆＞速溶咖啡冷冻粉＞速溶咖啡喷干粉＞速溶咖啡喷雾粉＞速溶咖啡凝聚粉＞速溶咖啡冻干粉＞焙炒咖啡豆；咖啡因含量为1.10%～4.62%，其含量平均值大小为速溶咖啡喷雾粉＞速溶咖啡冷冻粉＞速溶咖啡冻干粉＞速溶咖啡喷干粉＞速溶咖啡凝聚粉＞焙炒咖啡豆＞生咖啡豆。

表3 供试咖啡及咖啡制品类别及葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因含量%

表4 咖啡及咖啡制品葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因含量的方差分析%

咖啡及其咖啡制品中绿原酸含量差异变化最大，其变异系数高达180.20%，数据离散程度大，不同供试样品指标测定值差异大，这一结果与试验选择的不同加工工艺咖啡及产品有关；咖啡因次之，变异系数为101.80%；差异较小的为葫芦巴碱，其变异系数为37.94%。

2.3 主成分分析

主成分分析的目的之一是用尽可能少的因子来解释观测到的变量，主成分的特征根及贡献率是选择主成分的依据[24-25]。表5描述了主成分分析初始解对原有变量总体描述情况，其中，绿原酸和咖啡因为第1主成分，贡献率达到64.932%；葫芦巴碱为第2主成分，贡献率为34.944%，2个主成分累计贡献率为99.876%。

表5 总方差解释

由图3主成分散点图可知，生咖啡豆与咖啡制品区别较明显，生咖啡豆绿原酸含量比较高，由于绿原酸在整个烘焙加热过程中，受热分解，其酯键断裂，从而生成奎宁酸及阿魏酸、肉桂酸、咖啡酸等物质，使绿原酸的含量急剧下降；咖啡因热稳定性比较强，在烘焙加热过程中含量较为稳定，咖啡生豆内含10%左右的水分，经过高温脱水和高温反应等工艺，生咖啡豆中的水分逐渐减少，焙炒咖啡豆和速溶咖啡粉等样品比生咖啡豆咖啡因含量高；葫芦巴碱受热分解，生成大量的CO2及风味物质，所以，焙炒咖啡豆和速溶咖啡粉等制品的葫芦巴碱含量较生咖啡豆急剧下降。

2.4 聚类分析

进一步对7种类型的咖啡及咖啡制品46个样品进行系统聚类分析，聚类距离采用欧氏距离平方法，聚类方法采用ward法，得到46个咖啡及咖啡制品的聚类树状图（图4）。

由图4可知，46份咖啡及咖啡制品用绿原酸、咖啡因和葫芦巴碱含量作为聚类变量，可以把样品分为两大类，生咖啡聚为一类；焙炒咖啡豆、速溶咖啡喷干粉、速溶咖啡凝聚粉、速溶咖啡冻干粉、速溶咖啡冷冻粉和速溶咖啡喷雾粉聚为一类。通过比较聚类分析的结果发现，绿原酸、咖啡因和葫芦巴碱在咖啡不同加工制品之间存在一定的差异，焙炒咖啡豆与咖啡粉区别不明显，但从图中可以看出，焙炒咖啡豆、速溶咖啡喷干粉及凝聚粉聚在一起，速溶咖啡冻干粉、冷冻粉及喷雾粉聚在一起，这与主成分分析结果一致。

3 结论

本研究建立了咖啡及咖啡制品中葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因的高效液相色谱定量分析方法，葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因在0.05～50.0 mg/L范围内具有良好的线性关系，相关系数为0.999 5～0.999 8，检出限（LOD）为0.28～0.41 mg/L，定量限（LOQ）为0.81～1.16 mg/L；葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因的回收率分别为81.75%～117.2%，85.36%～112.4%和83.74%～110.9%，相对标准偏差（RSD）分别为4.06%～9.94%，3.68%～11.2%和2.87%～8.59%。咖啡及咖啡制品中，葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因含量分别为0.09%～1.41%，0.32%～6.24%和1.10%～4.62%。本研究提供了咖啡及咖啡制品中葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因含量测定的准确数据，为咖啡的深入研究提供了科学依据。主成分分析结果表明，葫芦巴碱、绿原酸和咖啡因是咖啡及咖啡制品的特征品质指标之一，绿原酸和咖啡因为第1主成分，贡献率达到64.932%，葫芦巴碱为第2主成分，贡献率为34.944%，2个主成分累计贡献率为99.876%。以葫芦巴碱、咖啡因和绿原酸含量为指标采用聚类分析可将供试样品分为生咖啡和咖啡制品两大类，聚类分析结果在一定程度上表明，绿原酸、葫芦巴碱和咖啡因在咖啡不同加工制品之间存在一定的差异。

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Comparative Analysis on Trigonelline,Chlorogenic Acid and Caffeine Content in Coffee and Its Product

SHAO Jin-liang，LIU Xing-yong，YANG Dong-shun，FAN Jian-lin，DU Li-juan，WANG Li，WANG Lu-xiang
（Institute of Agriculture Quality Standards＆Testing Technique，Yunnan Academy of Agricultural Sciences，Kunming650223，China）

A analytic method for simultaneous determination of trigonelline,chlorogenic acid and caffeine content in the green coffee beans,roasted coffee beans and coffee powder was developed by using high performance liquid chromatography.The content trigonelline,chlorogenic acid and caffeine of coffee and its product were compared by principal component analysis and cluster analysis using SPSS software.The sample was methanol-0.10%phosphoric acid（50∶50）solution after ultrasonic extraction,over PTFE membrane after Shiseido CAPCELL PAK MGⅡC18column（4.6 mm×250 mm,5.0 μm）column using methanol-0.10%phosphoric acid（12:88）solution as mobile phase isocratic elution,detection wavelength of254,320 nm.Trigonelline,chlorogenic acid and caffeine in the 0.05-50.00 mg/L range with good linear correlation coefficient（r）was 0.999 5-0.999 8,the detection limit（LOD）was 0.28-0.41 mg/L,the limit of quantification（LOQ）was 0.81-1.16 mg/L;rate of recovery of trigonelline,chlorogenic acid and caffeine were 81.75%-117.2%,85.36%-112.4%and 83.74%-110.9%,respectively,relative standard deviations（RSD）were 4.06%-9.94%,3.68%-11.2%and 2.87%-8.59%,respectively.Principal component analysis showed that trigonelline,caffeine and chlorogenic acid was characterized by quality indicators coffee and coffee products,chlorogenic acid and caffeine as the first principal component,the contribution rate was 64.932%,the second main trigonelline component contribution rate 34.944%,the two main components of the cumulative contribution rate 99.876%.In trigonelline,chlorogenic acid and caffeine content of indicators by cluster analysis of samples of coffee and coffee products were classified,coffee and its product could be divided into two categories,cluster analysis showed a certain extent different Yunnan coffee products trigonelline,chlorogenic acid and caffeine other key indicators of the quality of content differences,could provide scientific data and reference for the development of Yunnan coffee industry.

coffee and its product;trigonelline；chlorogenic acid;caffeine；comparative analysis

TS273

A

1002-2481（2016）02-0158-06

10.3969/j.issn.1002-2481.2016.02.07

2015-10-22

农业部2014年行业标准制定和修订项目（农质发2014[61]号-219）；云南省科技惠民专项（农业）重点项目（2014RA054）；云南省科技创新平台建设计划（公共科技服务）项目（2014DA001）

邵金良（1979-），男，云南陆良人，副研究员，主要从事农产品质量安全与分析检测工作。汪禄样为通信作者。