内淋巴积水动物模型研究进展

丁玉静 刘俊秀 马芙蓉

北京大学第三医院耳鼻咽喉头颈外科（北京100191）

·综 述·

内淋巴积水动物模型研究进展

丁玉静 刘俊秀 马芙蓉

北京大学第三医院耳鼻咽喉头颈外科（北京100191）

梅尼埃病是一种内耳疾病，临床表现以反复发作的旋转性眩晕，波动性感音神经性听力损失，耳鸣和/或耳胀满感为特征。梅尼埃病的病因尚不明确。众所周知，其病理特征为内淋巴积水，但内淋巴积水的具体作用机制尚未完全明确。已有研究证实，内淋巴囊在内淋巴体积调节、与慢性内淋巴积水相关的组织病理及电生理级联变化中具有重要作用。通过内淋巴积水动物模型研究积水产生过程、积水与病理及电生理变化的关系，以及这些变化是如何影响内耳功能的，可以帮助有效治疗梅尼埃病。梅尼埃病的周期性发作提示或许可以通过控制内淋巴积水使内耳维持稳定状态，避免进展性损伤及二次损伤。

梅尼埃病；内淋巴积水；动物模型

Fund project:Natural science foundation of China(21272018);National major research program(91213305);Capital health development and scientific research project(2016-2-4094).

Declaration of interest:The authors report no conflicts of interest

梅尼埃病（Meniere’s Disease,MD）根据法国医师Prosper Meniere的名字命名，因其于1861年首先报道该病。MD的临床表现为反复发作的旋转性眩晕，波动性感音神经性听力损失，耳鸣和/或耳胀满感，病理特征为内淋巴积水（endolymphatic hy⁃drops,ELH）。MD的病因迄今不明，1938年，Hall⁃pike和Cairns[1]首次描述了MD患者迷路的典型组织病理学变化，发现ELH与MD有关，通过两例病理切片资料证实球囊和蜗管扩大，前庭和前庭阶的外淋巴间隙消失。此后关于ELH在MD中的重要性逐渐被众多研究者所证实，Arenberg等[2,3]发现了前庭膜肿胀并移向前庭阶是ELH的典型表现，前庭膜破裂可能与MD发作及其功能改变有关。前庭膜顺应性变化可以解释同一患者不同时期积水程度的变化[4]。活体无法进行内耳组织病理学研究，因此内淋巴积水动物模型在MD基础研究中至关重要，本文将目前存在的内淋巴积水动物模型建立方法进行综述，为进一步研究MD发病机制提供依据。

内淋巴液由血管纹边缘细胞和前庭暗细胞分泌产生，此外，内淋巴空间的各种上皮细胞都有可能参与其生成。内淋巴液位于两端均为盲端的膜蜗管中，成分与细胞内液相似，以存在高浓度钾离子和低浓度钠离子为特点。内淋巴生成过多和/或吸收减少都会引起ELH，由此所导致的功能性结果取决于积水产生的时间。内淋巴界膜肿胀或移位产生的机械效应可导致急性内淋巴积水，反之，慢性内淋巴积水会发生生化和形态学改变。本文将分别对二者进行总结。

1 急性内淋巴积水动物模型

1.1人工内淋巴液注射法

通过向豚鼠内淋巴系统注射人工内淋巴液引起压力变化诱导ELH，是最直接最快速的内淋巴积水模型制备方法，通常行耳蜗内注射，积水程度取决于注射速度和体积。Kakigi[5]通过测量耳蜗内静息电位（endocochlear potential,EP）和-EP研究急性内淋巴积水。向蜗管内注射人工内淋巴液时测量EP，注射后测量-EP。研究发现，注射人工内淋巴液可引起短暂的EP轻微升高，-EP显著降低。慢速注射时，由于Corti器向鼓阶移位，电流减少，EP增加；内淋巴压力增高可直接导致-EP降低。耳蜗内电位变化随注射速度的快慢呈现明显的波动性，有助于解释MD患者的波动性听力损失。向豚鼠耳蜗中阶注入淋巴液体积大于3uL时（500nL/min，10min），可观察到前庭阶和鼓阶K+浓度升高，前庭阶升高更明显，并且认为K+浓度升高可能与MD发作时的眩晕和听力下降有关。Takeuchi[6]发现，快速注射时化学和机械创伤导致EP降低，EP降低可导致内耳慢性改变。Sirjani等[7]发现，注射速度达到200-400 nL/min时，在2.8K Hz和8K Hz，EP升高，和电位（summating potential,SP）升高。这些改变是在注射过程中短暂出现的，注射时压力增加，注射后很快恢复，注射时和注射后的压力变化时程与内淋巴液流动一致。此法诱导的急性内淋巴积水是由于注射过程中内淋巴压力改变引起内淋巴液生理变化所致，不同于内淋巴容积增加引起的慢性内淋巴积水。

1.2环磷酸腺苷调节法

最早的内淋巴积水模型建立方法之一是向内淋巴内注射霍乱毒素。Roheim[8]通过向豚鼠耳蜗中阶注射纯化的霍乱毒素成功诱导ELH。后来Lohuis[9]证明内淋巴稳态受中阶周围细胞的细胞内环 磷 酸 腺 苷（cyclic adenosine monophosphate, cAMP）水平调控，向外淋巴中注射霍乱毒素可诱导ELH，推测由于毒素激活中阶上皮细胞中腺苷酸环化酶（adenylate cyclase,AC）活性，导致细胞内cAMP升高，诱导内淋巴液大量分泌所致。具体方法：暴露豚鼠耳蜗，在耳蜗上钻两小孔，一个通向鼓阶，一个通向底转前庭阶，先通过鼓阶的孔向外淋巴液中灌注人工外淋巴液15min，然后灌注含有牛血清蛋白和霍乱毒素的人工外淋巴液。灌注后4小时通过耳蜗组织切片观察ELH程度。有学者证实抗利尿激素、催产素等可以通过激活AC，使细胞内cAMP浓度升高，导致ELH[10,11]。此方法建立内淋巴积水模型所需时间短，成功率高，但未进一步阐述积水持续时间和转归。

1.3透明质酸盐凝胶蜗顶注射法

发生ELH时，Corti器会向鼓阶移位。Salt[12]通过向豚鼠耳蜗顶转缓慢注射透明质酸盐凝胶，建立了内淋巴积水模型。注射后可观察到传感位点持续性变化、Corti器向鼓阶移动。注射时为了抵抗凝胶从鼓阶向耳蜗导水管移动，前庭阶和内淋巴压力增高，同时EP升高，这种变化开始于注射时并持续40min，注射结束后立即恢复。手术诱导的内淋巴积水动物模型中，发现部分动物对次声呈现高敏感性，推测可能由于积水导致耳蜗顶转前庭阶和鼓阶的外淋巴通路阻塞所致。此法诱导的内淋巴积水模型可以模拟Corti器向鼓阶移位，耳蜗内部电位变化有助于解释MD患者对低频压力改变的敏感性。

1.4 脑脊液压力调节法

Walsted A等[13,14]研究发现，单侧听神经瘤术后患者术后2周内对侧听力在多个频率下降大于20dB。术中脑脊液（cerebrospinal fluid,CSF）丢失，CSF压力降低，通过耳蜗导水管传至外淋巴，导致外淋巴张力减低，继而内淋巴压力增高，内淋巴积水，最终导致听力敏感性下降。据此，建立豚鼠模型，于枕骨下切开硬脑膜致CSF流失，CSF压力降低，内淋巴压力升高，建立内淋巴积水模型。Kurz⁃buch[15]证实MD合并正常颅压脑积水（normal pres⁃sure hydrocephalus,NPH）患者行CSF分流术后对CSF压力降低敏感，可能由此引起听力下降，因此可以通过及时补充丢失的CSF，升高CSF压力，预防MD合并NPH患者听力持续下降。CSF压力调节法创伤大，不能确保产生前庭症状，且为继发性内淋巴积水，与MD患者表现不吻合。

1.5低频噪声暴露法

Hirsh[16]研究发现暴露于低频噪声后，听阈提高，并且在再次升高前很快恢复正常。此后Kemp[17,18]证实，某些情况下低频噪声可以导致耳声发射及心理物理阈值敏感性增加，并维持在一个阈值不再提高的响度水平。Kirk DL[19]和Salt[20]在低频噪声暴露下建立豚鼠内淋巴积水模型，将豚鼠暴露于200Hz、115dB SPL的低频噪声环境中，3min后观察到膜迷路体积增加大于30%，并在暴露结束后数分钟内恢复，ELH时耳蜗敏感性未受损害。置于低频噪声暴露中时，观察到EP快速升高，可能由于渗透压不平衡，Corti器移向鼓阶，导致耳蜗敏感性增加。低频噪声暴露法可以快速建立内淋巴积水模型，缺点是产生的积水不稳定。

2 慢性内淋巴积水动物模型

2.1手术阻塞内淋巴囊法

内淋巴囊在内淋巴体积调节、病理生理学和电生理学级联变化中具有重要作用。Portmann G首先提出打开内淋巴囊治疗MD的方法，1926年他尝试了第一次手术，经乳突路径打开内淋巴囊，治疗伴有极重度眩晕的MD患者，术后患者报告眩晕症状得到了彻底控制[21]。据此，1965年，Kimura等[22]采用顶枕入路首次通过手术阻塞内淋巴囊建立内淋巴积水豚鼠模型。具体方法：豚鼠麻醉后作头皮正中切口，切除枕骨大孔背侧缘至人字缝的枕骨。在小脑处切开硬脑膜，岩骨近横窦处小龛即内淋巴囊中部标记，用钻头钻穿前庭导水管，破坏内淋巴囊后沿导管方向继续追进，最后在钻孔内置入骨蜡阻塞内淋巴囊和内淋巴管，枕骨缺损处填塞明胶海绵，缝合皮肤。术后数天到数周出现前庭膜肿胀、移向前庭阶，术后1月组织切片结果显示67%的术耳出现中、重度ELH。此模型在无大量毛细胞死亡和前庭血管纹损害的情况下，诱导出明显的ELH。随后的功能学研究显示，低频刺激时耳蜗微音电位降低，可能与内淋巴液中Ca2+增加有关[23,24]。后经学者证实，此模型可用于研究与人类MD有关的ELH[25-27]。在此基础上，Konishi[28]创立了后颅窝硬膜外入路内淋巴囊阻塞术。豚鼠麻醉后行颅顶正中切口，磨去术侧枕骨，暴露硬脑膜及乙状窦，剥离硬脑膜至乙状窦前缘，在前庭导水管颅内开口处切断内淋巴囊，再用微电钻沿前庭导水管方向钻入，破坏内淋巴囊骨内部和部分内淋巴管，最后填充骨蜡、明胶海绵，缝合切口。术后观察到耳蜗微音电位和球囊电位降低，这与上面提到的cAMP调节法不同，说明ELH的电化学效应可随诱导因素不同而升高或降低。后来，Dunnebier[29]通过手术分离乙状窦和内淋巴囊骨外部，其间填充明胶海绵，使得内淋巴囊末端中度纤维化，阻碍静脉血回流至乙状窦，导致ELH。

组织病理学变化首先表现为外毛细胞的静纤毛减少，从顶转开始，随后出现内毛细胞减少，顶转为著[30,31]。外侧壁首先出现螺旋韧带纤维细胞的改变，随后可观察到边缘细胞间水肿，边缘细胞和中间细胞萎缩，囊泡增加[32]。扩张的前庭膜间皮细胞消失、上皮细胞增加，与人类ELH类似[33]。ELH晚期表现为螺旋神经节细胞减少，首先累及顶转[34,35]。

手术阻塞内淋巴囊法优点是成功率高，可达100%[36]。但此法存在很多局限性：首先手术操作技术要求严格，且手术破坏性大，动物易感染致死。其次，不能确保引起前庭症状[37]。再次，手术阻塞后内淋巴囊完全失去功能，与MD患者表现相悖。另外，此模型只能解释存在颅内解剖异常影响内淋巴回流的现象，临床上很多患者并无解剖异常，此模型并非MD的生理模型。

2.2两期法

鉴于手术阻塞内淋巴囊法的局限性，在此基础上，研究人员开始探索新的动物模型建立方法。1997年，Dunnebier[29]将部分内淋巴囊功能障碍与急性应激诱发内淋巴生成相结合，建立了两期法内淋巴积水豚鼠模型。方法：豚鼠麻醉后经颅后窝硬膜外径路暴露内淋巴囊，打开部分内淋巴囊，在不损伤骨内部的情况下，分离其远端部，轻度破坏最远端造成部分内淋巴囊功能障碍。术后第3周起腹腔注射醛固酮，连续5天，刺激血管纹上Na+/ K+-ATP酶，K+分泌增多，使得内淋巴液生成速率加快，导致内淋巴生成过多，3周后通过耳蜗组织切片观察积水程度。Ten[38]研究证实部分内淋巴囊功能障碍也可导致ELH，醛固酮可能会加重ELH。两期法是较为理想的动态模型，部分阻塞内淋巴囊导致内淋巴吸收减少，此法产生的ELH主要影响耳蜗顶转致低频听力下降；腹腔注射醛固酮诱发内淋巴产生增多，影响耳蜗底转致高频听力下降，可以解释MD手术刺激致低频听力下降、药物注射致高频听力下降等症状。

2.3系统性血管加压素法/电灼内淋巴囊后注射去氨加压素

血管加压素(vasopressin,VP)是由下丘脑视上核和室旁核神经细胞分泌的九肽激素，以神经内分泌颗粒形式经下丘脑—垂体束到达神经垂体后叶后释放出来，其主要作用是提高远曲小管和集合管对水的通透性，促进水的吸收。Mees[39]研究证实耳蜗内存在VP受体，分为V1和V2两种亚型。1993年Agre[40]发现水通道蛋白(aquaporin,AQP)，后来Nielsen[41]证实水重吸收的精确调节取决于AQP2，在VP刺激下，渗透压可以快速改变。V2受体存在于耳蜗外侧壁和内淋巴囊，通过控制AQP的表达调节耳蜗内水流运动[42]。Kitano等[43-47]证实VP与ELH密切相关，VP-AQP2激活导致内淋巴液产生过多。Taked通过皮下埋植VP微泵1周，成功诱导豚鼠内淋巴积水模型，成功率100%[45]。去氨加压素是V2受体激动剂，激活AC使得细胞内cAMP升高，引起血管加压素样可逆的内淋巴电位降低。Naoya Egami[48]将豚鼠麻醉后，行背中线头皮切口，去除左侧枕骨，经硬膜外径路暴露内淋巴囊，通过双极电凝烧灼内淋巴囊骨外部阻塞内淋巴囊，然后给予去氨加压素，诱导耳蜗和球囊重度积水，并观察到平衡障碍和自发性眼震。研究中还揭示了眩晕发作的机理：通过激活VP-AQP2系统导致内淋巴液生成过多，同时外淋巴向内淋巴回流增多，导致内淋巴压力突然变化，存在慢性内淋巴功能障碍时，内淋巴压力突然增高引起内淋巴液吸收减少，导致MD相关临床症状。通过VP诱导豚鼠ELH成功率高，所需时间短，但是关于此法诱导的ELH转归尚无相关文献报道。

2.4脂多糖、醛固酮联合肾上腺素法

脂多糖是从大肠杆菌中提取的一种毒素，可以诱发免疫反应，引起非感染性迷路炎。醛固酮是由肾上腺皮质球状带分泌的盐皮质激素，通过调节肾脏对钠离子的重吸收，维持水盐平衡。Ta⁃kumida M[49]通过联合应用脂多糖和醛固酮诱导出轻到中度ELH，但未模拟出前庭功能紊乱症状，因此加用肾上腺素。肾上腺素通过调节血管纹边缘细胞K+分泌，加重内淋巴囊骨内部扩张。具体方法：连续5天左侧鼓室内注射脂多糖，腹腔注射醛固酮，并在鼓室内注射肾上腺素，诱发前庭功能障碍。注射肾上腺素后5min内小鼠出现前庭功能障碍症状，最严重时难以维持姿势稳定，向左侧（注射侧）倾斜、不能游泳、走路时趋向左转，同时有晕厥，红外Frenzel眼镜可记录到明显的眼震（向右侧-非注射侧）。注射后10min症状最明显，持续30min后逐渐恢复，1h后前庭功能恢复正常。观察期内未见共济失调和肌张力减弱。Miller JM[50]研究发现，局部应用肾上腺素后，耳蜗血流立即下降至基线水平的20%并维持此水平5min，推测内耳血流量锐减导致前庭功能障碍。此模型的优点在于操作简单，无需开颅手术，对脑组织损伤小，可以分别单独评价内淋巴系统和内淋巴囊，缺点是使用药物种类多，难以排除内源性相关因素干扰。

2.5免疫法

内淋巴囊是内耳的主要免疫应答部位，近年来，许多学者发现ELH与内淋巴囊局部免疫反应关系密切。钥孔嘁血蓝蛋白（keyhole limpet hemo⁃cyanin,KLH）是T细胞依赖性抗原，具有高度免疫原性。Watanabe[51]先诱导豚鼠全身KLH致敏，2周后再行全身加强免疫，然后内淋巴囊内注射KLH行局部免疫。通过耳蜗组织切片观察积水程度，内淋巴囊免疫后第2天积水发生率即达100%，并持续至第7天，随后积水程度逐渐下降，2个月后积水发生率又逐渐升高。前庭膜扩张，移向前庭阶，检测到从底转到顶转的一氧化氮合酶免疫反应。高水平一氧化氮可导致内耳功能障碍，通过免疫组化检测豚鼠耳蜗内诱生性一氧化氮合酶（inducible nitric oxide synthase,iNOS）的表达，结果发现耳蜗外侧壁、Corti器和螺旋神经节iNOS表达增加，推测iNOS在ELH中起调节作用。免疫法的优点是成功率高，ELH随时间变化有可逆部分，也有不可逆部分，可模拟MD反复波动性发作。局限性是观察周期长，模型不稳定，外淋巴液中产生大量炎性细胞，而MD患者外淋巴液中无炎性细胞。

2.6 Phex基因小鼠模型

基因突变小鼠模型广泛用于研究内耳疾病。Lorenz[52]于2004年首次阐述了PhexHyp-Duk基因突变鼠，此鼠在Phex有功能丧失性突变。Phex与X连锁低磷酸盐血症性佝偻病相关，半合子雄性小鼠（PhexHyp-Duk/Y）会出现一系列表型，包括骨质增厚、ELH和听力损失，并伴有前庭功能障碍症状：摇头、步态不稳和/或转圈行为。雌性小鼠也会出现周期性转圈行为，但雄性小鼠表型更明显、更稳定，且已被Phex基因分型所证实，因此选择携带Phex⁃Hyp-Duk等位基因雄性小鼠用于研究ELH。研究发现，5月龄小鼠耳蜗管层面可见：鼓阶出现沉积物，耳蜗周围骨质增厚、内淋巴管阻塞和ELH，内淋巴管阻塞与周围骨质增厚有关。但内淋巴管阻塞不是ELH的先决条件，因为野生型鼠发生积水时无内淋巴管阻塞。Semaan等提出假说，ELH可能与螺旋神经节细胞退化有关[53]。

PhexHyp-Duk基因突变鼠出生后21-30天开始出现听力损失。病理和形态学检查显示：听功能退化多始于出生后3-4周，低频听力损失早于高频听力损失。大部分螺旋神经节细胞退化后，耳蜗顶转毛细胞相对保留，与MD患者表现一致[26,54]。神经元和毛细胞死亡是晚期事件，不是听力损失的原因。未观察到明显的血管纹病理学改变，表明最初的听力损失与血管纹无关，但血管纹正常并不代表蜗内电位正常，为评估内耳血管纹状态需在多个时间点测量蜗内电位。

PhexHyp-Duk基因突变鼠用于研究ELH的优点在于无须手术、自发产生积水，表型可重复观测，基因检测简便易行。亦存在许多局限性：首先记录发作性眩晕困难。其次根据前庭膜肿胀程度判断ELH程度，不能准确反映内淋巴稳态失调的发生起点和严重程度，小鼠生存期为2年，MD患者通常在30岁以上出现内淋巴积水，难以等同。再次，其进行性听力损失与MD波动性听力损失不一致，除ELH外，内耳和中耳骨质异常也可引起听力损失，中耳炎易感性使得患耳阈值增加10-15dB，加重听力损失程度[55]。基因突变对其他系统的影响尚需进一步研究。

3 思考与展望

MD是常见的内耳疾病，导致发作性眩晕、波动性感音神经性听力损失、耳鸣、耳闷胀感，影响患者生活质量，严重时可以致残。MD病因不明，唯一明确的是其病理改变为ELH。MD没有特异性生物学标志物，临床诊断依据症状诊断和排除诊断，实验室诊断和临床治疗针对发现和控制ELH。内淋巴积水动物模型有助于了解ELH对内耳解剖和功能的影响，为研究MD的发病机制、病理表现和治疗方法提供有利条件。综上所述，内淋巴积水动物模型建立方法多种多样，各个模型虽有自身的特点和优势，但也都存在一定的局限性。迄今，无一种动物模型与MD患者的症状、体征和病理改变完全吻合，并非所有模型都能模拟波动性听力损失和前庭症状。除PhexHyp-Duk基因突变鼠以外，其他模型均是通过手术、声创伤或药物诱导产生ELH，与MD患者自发性发生ELH不符。PhexH⁃yp-Duk基因突变鼠虽然自发产生ELH和听力损失，但中耳炎、内耳和中耳骨质异常也可引起听力损失，且基因突变可对多个系统造成影响，难以排除其他系统干扰。目前所有模型均是在处死动物后，通过耳蜗组织切片判定模型是否制作成功，至今尚无在体研究ELH的特异方法，不利于建模成功后开展进一步研究。研究者应根据自身实验目的、实验条件，结合模型建立成功率和所需时间选择合适的方法。此外，ELH并非MD所独有，创伤、内淋巴囊肿瘤、脑膜瘤、听神经瘤和复发性多软骨炎均可以导致继发性内淋巴积水。进一步深入研究MD发病机制，排除内源性和外源性干扰因素建立简便可行的内淋巴积水动物模型或在体研究方法，建立更加客观的眩晕、耳鸣、耳胀满感评价方法和指标，是今后需进一步完善、努力的方向。

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Research Progress inAnimal Models of Endolymphatic Hydrops DING Yujing,LIU Junxiu,MAFurong

DING Yujing,LIU Junxiu,MA Furong
Department of Otolaryngology Head and Neck Surgery,Peking University Third Hospital,Beijing,100191,China Corresponding author:MA Furong Email:furongma@126.com

Meniere’s disease is an inner ear disorder characterized by recurrent episodes of rotational vertigo,fluctuating sensorineural hearing loss,and tinnitus,with or without ear fullness.The pathogenesis of Meniere’s disease is unclear.The typical pathological feature of Meniere’s disease is endolymphatic hydrops,although the precise mechanism is not fully understood.Studies have confirmed that endolymphatic sac plays an important role in endolymph volume regulation,and the cascade of histopathological and electrophysiological changes associated with chronic endolymphatic hydrops.Using the animal model of endolymphatic hydrops to investigate variable aspects of the disease(e.g., how hydrops occurs,its relationship with pathology and electrophysiology changes,how it affects the inner ear function,and so on)would be helpful to guide the treatment of the disease.The periodic episodes of Meniere's disease suggest that controlling the endolymphatic hydrops might be the key to maintain the inner ear homeostasis and to avoid progression of the disease.

Meniere’s Disease;Endolymphatic hydrops;Animal model

R764.33

A

1672-2922（2017）01-99-6

2016-11-27审核人：郭维维）

10.3969/j.issn.1672-2922.2017.01.019

国家自然科学基金资助项目（21272018）；国家重大研究计划资助项目（91213305），首都卫生发展科研专项项目（2016-2-4094）。

丁玉静，博士，住院医师，研究方向:耳鼻咽喉科学基础研究

马芙蓉，Email:furongma@126.com