金黄色葡萄球菌小菌落突变株研究进展及其临床意义

何春燕， 刘庆中

金黄色葡萄球菌小菌落突变株研究进展及其临床意义

何春燕， 刘庆中

金黄色葡萄球菌； 小菌落突变株； 临床意义

金黄色葡萄球菌（金葡菌）能够引起从症状轻微的皮肤软组织感染到威胁生命的脓毒血症等各种临床感染。在感染过程中，该菌能够形成一种特殊的变体——小菌落突变株（small colony variants， SCV）。金葡菌SCV早在100多年前就已报道，20年前因发现其与持续性、复发性难治金葡菌感染相关而受到关注[1]。与正常菌株相比，金葡菌SCV生长缓慢、菌落形态不典型、生化反应不活跃，给临床实验室的常规分离和鉴定带来很大挑战[2-3]。金葡菌 SCV能适应胞内生存。这种生存方式的改变同时伴随着细菌代谢的深刻变化，显著影响病原菌与宿主间的相互作用，结果常导致以SCV感染为特征的慢性难治性感染[1]。另外，胞内生存方式还可保护细菌免受抗菌药物和宿主防御系统的攻击，加之SCV自身对一些抗菌药物敏感性的降低[2]，使得金葡菌SCV感染的危害更为严重。当前，金葡菌SCV感染不仅存在于人类，在畜牧兽医学和食品微生物学领域也有报道[3]。本文就当前研究文献，对金葡菌SCV的特征、分类、抗菌药物敏感性、实验室分离鉴定、形成机制、临床意义及治疗方案等方面综述如下。

1 金葡菌 SCV特征

金葡菌SCV典型特征是生长代谢缓慢、菌落细小（为正常菌株的1/10左右）、色素合成能力低下、溶血性下降、凝固酶反应迟缓、毒力基因表达下调，与生物膜形成和黏附相关的主要基因常常表达增加[4]。菌落细小多由细菌缺乏甲萘醌（维生素K3）、氯化血红素和/或胸腺嘧啶核苷等生长因子所致[2]。SCV常常不太稳定，生存于宿主细胞内的SCV可恢复成高毒力、快速生长的正常形态菌株，使宿主细胞裂解导致复发或慢性感染[5]。

2 金葡菌SCV的营养缺陷分类

尽管细菌代谢途径中的很多变化都可以导致缓慢生长，但目前为止，临床上已发现并能明确具体营养缺陷类型的SCV主要是电子传递链缺陷型（血红素和甲萘醌缺陷型）、胸腺嘧啶合成缺陷型和CO2依赖型。

2.1 电子传递链缺陷型

功能性或遗传性甲萘醌和氯化血红素合成缺陷导致电子传递链缺陷，进而ATP合成显著降低，从而形成SCV表型。以往临床报道的此种类型SCV常分离自氨基糖苷类抗菌药物治疗的患者，它们可以通过补充甲萘醌或血红素回复至亲本株表型。几个基因的突变与电子传递链缺陷型SCV形成密切相关。hemB（编码胆色素原合酶）和menD [编码2-琥珀酰-6-羟基-24-环巳二烯-1-甲酸（SHCHC）合成酶]突变可阻断甲萘醌和血红素的生物合成；ctaA突变可阻断血红素A（HemA，与细胞色素生物合成相关）的生物合成，进而影响细胞色素的合成。电子传递链缺陷型SCV在代谢上的主要特征为三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA循环）减弱或缺乏。研究显示，在这类SCV菌株中主要是acnA基因（编码顺乌头酸酶）表达降低，导致TCA循环途径碳通量减少[1，6-7]。电子传递链缺陷型SCV另一特点是不表达金葡菌附属基因调节子（accessory gene regulator，agr）的效应分子RNA III[1，7]。另外，金葡菌SCV和其亲本株的cDNA文库数据显示，表型特异的非编码蛋白RNA（non-proteinencoding RNA，npcRNA）的表达可能也在SCV的形成中发挥作用[8]。

2.2 胸腺嘧啶脱氧核苷（TD）合成缺陷型

2.3 依赖型SCVCO2

CO2依赖型SCV可分离自不同感染的患者（如手术伤口感染、医疗装置相关感染、皮肤软组织感染等）[10]，当其处于5% CO2环境中时又可恢复为正常形态的菌株。但是目前有关金葡菌CO2依赖型SCV的形成机制及代谢上的变化还是空白。

另外，临床上还分离到一些目前仍不能确定具体营养缺陷类型的SCV，其机制可能涉及呼吸链的其他环节障碍导致SCV表型产生。

3 影响金葡菌SCV形成的其他因素

虽然在感染进程中，金葡菌能够自发形成SCV表型[11]，但临床上分离的金葡菌SCV主要还是与抗菌药物的长期使用有关。随着研究的深入，发现越来越多的体内外因素与SCV形成密切相关。

3.1 喹诺酮类药物

体外用亚抑菌浓度喹诺酮类药物作用金葡菌24 h后出现SCV和正常菌株的混合表型。该种SCV在补充氯化血红素、甲萘醌或胸腺嘧啶脱氧核苷后仍不能回复为正常形态的亲本菌株，表明其不是传统概念上的SCV（电子传递链缺陷型或胸腺嘧啶脱氧核苷合成缺陷型）。此种SCV形成的机制可能是影响ATP生成的其他途径（如TCA循环酶）相关基因发生突变所致[12]。

3.2 三氯生

三氯生是一种人工合成的双酚类消毒剂，作为抗菌添加剂广泛应用于健康卫生保健领域。研究显示，亚致死剂量的三氯生能够诱导金葡菌形成非氯化血红素、甲萘醌或胸腺嘧啶脱氧核苷缺陷型的SCV表型，推测细胞壁形成缺陷可能是其产生机制[13]。

3.3 铜绿假单胞菌（共生细菌）

金葡菌与铜绿假单胞菌共同生长时，后者的胞外产物4-羟基-2-庚基喹啉氮氧化合物（HQNO）会对金葡菌的呼吸产生抑制效应，继而导致金葡菌SCV的产生。一种名为多重耐药-ABC转运蛋白通透酶（multidrug resistant-ABC transporter permease）的蛋白可能参与了SCV的形成。这种通透酶通过将外源性分子排出胞外以减少后者对细菌的损伤作用。金葡菌与铜绿假单胞菌共培养时，能够上调并大量表达多重耐药-ABC转运蛋白通透酶的金葡菌存活下来并表现为SCV表型[1，14]。

4 调节金葡菌SCV形成的分子

4.1 agr群感系统

agr（accessory gene regulator system，附属基因调节系统）是金葡菌上调胞外毒素和胞外酶表达的重要双组份系统。在感染急性期，agr系统过表达，进而上调毒力因子的表达，使得细菌能够对抗免疫细胞攻击、破坏侵入组织，并进一步在深部组织建立感染。侵入宿主细胞后，细菌agr系统表达下调，使得细菌获得长期生存和形成SCV的能力[15]。

4.2 SigB

SigB（sigma factor B）是应激相关的转录因子，有助于细菌应对各种不利的压力条件。研究表明，sigB基因缺失株不具有形成SCV的能力，而在一些特殊环境下，如金葡菌与铜绿假单胞菌共存时，后者的胞外产物就能激活前者的SigB，抑制其呼吸作用，从而诱导金葡菌SCV形成；另外，在慢性感染过程中SigB促进生物膜形成和黏附素的表达。由此认为，SigB与细菌胞内长期生存和SCV动态形成具有重要相关性[1，15]。

4.3 RelA水解酶

Gao等[16]报道了一种金葡菌SCV形成的新机制。该菌株relA基因上的1个核苷酸突变导致RelA水解酶活性降低，从而给细菌造成了长期的与SCV形成相关的严苛应激条件。

4.4 活性氧

亚致死浓度过氧化氢产生的活性氧自由基能够抑制金葡菌增殖，诱导编码菌株DNA修复系统RexAB、重组酶A和多聚酶V蛋白的基因发生突变，进而导致庆大霉素耐药SCV的形成[17]。

4.5 阳离子蛋白

金葡菌进入胞内后被吞噬形成吞噬体，吞噬体内的酸性环境可以诱导SCV形成[18]，由于宿主胞内主要是阳离子环境，故而推测可能是胞内的阳离子蛋白对SCV进行了选择。不过，目前并不清楚具体的物质类型，有待进一步探究。

5 临床意义

金葡菌感染的一个显著特征是即使进行了正确适当的抗菌药物治疗，感染也会转为慢性或经常复发，这一现象与其形成SCV密切相关。因为SCV表型菌株毒力减弱，易于在宿主细胞内生存从而逃避免疫系统攻击和抗菌药物作用[4]。即使没有任何选择性压力存在，金葡菌在连续的复制分裂过程中也可形成SCV[11]，但未见有其SCV分离自急性感染的报道。

据文献报道，氨基糖苷类治疗金葡菌感染易于形成电子传递链缺陷型SCV，而甲氧苄啶-磺胺甲唑治疗则与TD-SCV的形成密切相关[1，19]。Tuchscherr等[20]研究显示，莫西沙星和克林霉素也能促进SCV的形成。不过，当前仍有许多SCV的形成与抗菌药物治疗间关系不明。

金葡菌SCV可分离于多种类型的临床标本，表明其与多种感染相关。目前，各有1例金葡菌SCV引起的起搏器相关感染和人工心脏瓣膜感染性心内膜炎的报道[1，21]。有3项研究报道了金葡菌SCV导致的持续性、复发性人工关节感染[1]。Sendi等[22]和Tande等[23]报道分别有6.0%（5/83）和33.6%（38/113）的人工关节感染与金葡菌SCV有关。金葡菌SCV与皮肤、黏膜、软组织和伤口等的慢性感染也有一定的关系[1]。Tan等[24]和Kim等[25]在慢性鼻窦炎组织标本中也分离出黏膜内金葡菌SCV。此外，已有金葡菌SCV分离自Darier病（毛囊角化病）的皮肤感染标本[1]。不过，金葡菌SCV还是最常分离自囊性纤维化（cystic fi brosis）患者的气道感染标本。囊性纤维化是一种先天性遗传性疾病，主要发病于欧美国家的白种人，患者多死于慢性细菌感染导致的呼吸衰竭。囊性纤维化患者的气道具有一种独特的环境，如中性粒细胞聚集、缺氧、共感染细菌间的竞争及抗菌药物的选择压力等，在这种情况下细菌易于形成各种适应形式，如形成SCV[1]。此外，在乳腺导管闭锁导致的乳腺脓肿及2型糖尿病病足中也有分离到金葡菌SCV的报道[26-27]。

6 实验室诊断

金葡菌SCV不典型的生理、代谢和形态特征给常规的实验室检测带来挑战。及时、正确的分离鉴定SCV在临床上具有重要意义，一是可以提示慢性感染的存在，二是为制定针对性的治疗方案提供依据。因此，为了正确分离鉴定出金葡菌SCV应该遵循以下原则。

6.1 临床标本

组织样本优于拭子，并立即送至实验室培养，确保SCV得以正确培养并避免因细胞崩裂SCV从胞内释放而发生表型转换复原。对非囊性纤维化相关感染，标本质量至关重要，如关节抽出液、术中留取的组织标本、活检标本或液体标本最佳，尽量避免采用拭子采样送检；对医疗装置或骨样本，超声处理能够提高SCV培养的阳性率。对囊性纤维化感染，除了常用的痰液外，深部喉拭子也可用于SCV培养[1]。

6.2 培养和鉴定

金葡菌SCV的特性给临床检测带来不少困难，常常被忽视或错误鉴定。SCV菌株的分裂时间大约是正常形态菌株的6倍，在固体培养基上需要培养24 h以上（大多要48～72 h）才能长成肉眼可见的菌落。血平皿上培养24 h，对于针尖样大小[正常菌落大小（1～3 mm）的1/10左右］、无或减少的金黄色色素（白色菌落）、无或减少的β溶血现象的菌落应高度怀疑为SCV。对于TDSCV还会出现边缘半透明中间色素偏深的“油煎蛋”样菌落。由于金葡菌SCV菌落形态容易与生长缓慢的棒状杆菌、无溶血现象的链球菌或凝固酶阴性葡萄球菌混淆，需注意鉴别。尤其是SCV与形态正常的亲本菌株混合存在时更容易认为是杂菌而被忽视[1]。另外，在金葡菌选择或显色培养基上，大多数SCV不发生颜色变化。

SCV为厌氧代谢，TCA循环途径碳通量减少，加之生长缓慢，导致其生化反应减弱或缺乏，致使一些经典的鉴定反应如发酵、氧化及多种底物分解不能正常发生，从而发生菌株的错误鉴定甚至是不能鉴定，即使是现代的微生物鉴定系统也是如此。另外，触酶、凝固酶试验及其他用于初步鉴定的试验也会阳性时间延迟甚或阴性。所以基于生化反应方法鉴定金葡菌SCV的结果非常不可靠。种特异性聚合酶链反应（PCR）检测和种系标志性基因测序对于鉴定SCV是一个比较好的方法，如16S rRNA或rpoB基因测序，nuc、clfA、eap、coa和sodM等基因的PCR检测都可以用于金葡菌SCV的鉴定[1]。随着质谱技术在临床微生物学中的应用，也是鉴定金葡菌SCV的可靠方法[1]。

7 抗菌药物敏感性试验

由于SCV生理和代谢上的特点，影响常规药敏试验检测方法的培养时间和细菌密度都会发生改变，因此检测SCV菌株的抗菌药物敏感性比较困难。对MIC的解释应当十分谨慎。某些特殊菌株其SCV和亲本菌株的MIC值一致，但药效学研究显示药物的抗SCV效果却显著下降[2]。对于金葡菌SCV菌株甲氧西林耐药性的检测，PCR扩增mecA、mecC基因或胶乳凝集法检测PBP2a比较可靠。能为SCV抗菌药物敏感性提供指导作用的是琼脂稀释法或E试验。药敏检测时平皿需放置5% CO2培养箱2～3 d[2]。即使如此也要注意结果的判读，因为对某些药物很难获得清晰可靠的药敏结果[1-2]。

8 金葡菌SCV耐药性

对于SCV的耐药性目前尚无大样本量的流行病学调查研究。零星的报道显示，SCV菌株对大多数抗菌药物的MIC与其正常表型的亲代菌株类似。但由于导致缺陷机制的原因，氨基糖苷类和抗叶酸类抗菌药物分别在电子传递链缺陷型和胸腺嘧啶脱氧核苷合成缺陷型SCV中几乎全部丧失活性[2]。某些菌株的SCV和亲本菌株MIC相比较虽然没有差别，但药效学研究显示抗菌药物的抗SCV效果显著下降，如达托霉素（需高浓度延长治疗时间才能起到杀菌作用）、万古霉素和β内酰胺类（抗电子传递链缺陷型SCV效果减弱）[2]。喹诺酮类药物对电子传递链缺陷型和胸腺嘧啶脱氧核苷合成缺陷型SCV高度有效，而庆大霉素只对胸腺嘧啶脱氧核苷合成缺陷型SCV发挥作用[2]。

9 金葡菌SCV相关感染的治疗

目前，临床上仍无葡萄球菌SCV感染的最佳治疗方案。但根据SCV菌株的特点有以下因素需要考虑：①根据营养缺陷类型判断SCV的总体耐药特性；②宿主细胞内的定位；③亲本菌株和/或SCV菌株的药敏试验结果；④感染部位的药效学特点。由于SCV菌株常与亲本菌株共同出现或是可回复为正常表型菌株，在治疗时抗菌药物的使用应该覆盖2种表型的菌株。理想的抗SCV菌株的治疗方案应该包括能够穿透宿主细胞，并具有抗这种缓慢生长表型的抗菌药物。在临床实践中，经常将利福平或氟喹诺酮类联合其他种类抗菌药物治疗SCV感染，这种联合治疗对清除胞内SCV非常有效[1]。对于青霉素耐药甲氧西林敏感金葡菌SCV感染，可用耐酶β内酰胺类青霉素或第一、二代头孢菌素治疗。对青霉素敏感SCV感染，青霉素就可用于治疗。而对青霉素敏感性不确定的SCV，在选用青霉素治疗的同时，可增添β内酰胺酶抑制剂类抗菌药物。对于甲氧西林耐药金葡菌（MRSA）SCV感染，则可用万古霉素治疗，持续严重感染者需用糖肽类抗菌药物联合方案或其他抗MRSA活性的抗菌药物治疗（对SCV，万古霉素不是杀菌剂）[1]。

10 展望

SCV是一种异质性很大的细菌群体，其形成机制多样、毒力及耐药水平各异、实验室检测困难。在感染期间，不同的SCV形成机制以时间依赖性方式发挥作用。感染早期，细菌借助其对环境变化适应性的调节机制快速形成SCV。通过这种方式，病原菌能够侵入宿主细胞，从而逃避免疫系统攻击及抗菌药物的杀伤作用。如果宿主免疫机制和抗菌药物不能有效清除细菌，根据感染类型和抗菌药物的选择性压力，细菌可以在电子传递链系统或嘧啶合成上进一步发生突变，形成持久的SCV。所以，为了有效地治疗SCV感染，如何提高实验室诊断（如鉴定、药敏）技术水平及探索出既能清除SCV又能防止产生SCV的治疗方案是一个有待深入研究的领域。目前，我们正在探索模拟临床抗感染用药，利用临床菌株诱导获得稳定金葡菌SCV表型的方法，当下已获得甲氧苄啶-磺胺甲唑药物诱导产生的稳定型金葡菌SCV，继而对其进行包括基因水平、转录水平以及蛋白质水平的研究，从而为发展更为有效的SCV鉴定及治疗方法探索新思路、新靶点。

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Research updates and the clinical implications of Staphylococcus aureus small colony variants

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