市售《中国药典》2015年版非无菌产品微生物限度检查用培养基质量评价

解 慧，路立京，曹晓云

(天津市药品检验所，天津 30070)

市售《中国药典》2015年版非无菌产品微生物限度检查用培养基质量评价

解 慧，路立京，曹晓云

(天津市药品检验所，天津 30070)

目的：对市售微生物限度检查用培养基质量状况进行考查，有助于保证微生物限度检查结果的准确性，并对相关实验所需培养基的选购提供数据参考。方法：根据《中国药典》2015年版通则1105和1106，对对照培养基及5个厂家共18种培养基分别进行理化性质、回收率、促生长能力、抑制能力和指示特性检验。结果：3个厂家生产的共6种培养基高压灭菌后需要对pH值进行调整，2种培养基的微生物学性能欠佳。结论：各实验室需要按照《中国药典》要求对购买的培养基进行质量验收，剔除不符合要求的培养基，保证试验结果的准确性。

微生物限度检查，培养基，质量控制

药品及其原辅料微生物污染的监控是药品质量和安全性评价的重要指标，《中国药典》、《美国药典》、《欧洲药典》等均收载了微生物限度检查内容[1-3]。《中国药典》2015年版在微生物限度检查方法和指导原则上均做了较大的修订，修订后的微生物限度检查方法与欧美药典基本一致。

微生物限度检查包括微生物计数和控制菌检查两项，其结果受到样品本身的均一性、试验方法的合理性、试验条件和试验人员技术水平等因素影响。培养基是试验条件的重要组成部分，培养基所用原料和工艺不同可能对微生物生长带来不同影响。因此对目前市售的培养基进行质量检查是十分必要的。培养基的质量指标主要包括外观、pH值、澄清度、干燥失重，以及特定微生物性能。本试验分别对市售5个厂家的计数培养基和3个厂家控制菌检查培养基，依据《中国药典》2015年版进行适用性检查，并参考各培养基质控报告，对色泽、形态、澄清度和pH值等指标进行了考查，揭示市售培养基的相对质量情况，有助于保证微生物限度检查结果的准确性，并对相关实验所需培养基的选购提供数据参考。

1 仪器与试药

天平(sartorius TE612-L)，pH计(METTLER FE20)，灭菌锅(Sanyo MLS- 3780)，恒温培养箱(BINDER KB720)，生物安全柜(BAKER SG-403A TX-INT)，烤箱(Yamato DKN812 C)，VITEK2生化鉴定仪(梅里埃)。大肠埃希菌[CMCC(B)44102]、金黄色葡萄球菌[CMCC(B)26003]、枯草芽孢杆菌[CMCC(B)63501]、白色念珠菌[CMCC(F)98001]、黑曲霉[CMCC(F)98003]、铜绿假单胞菌[CMCC(B) 10104]、乙型副伤寒沙门菌[CMCC(B) 50094]、生孢梭菌[CMCC(B)64941]均购自中国药品生物制品检定所；铜绿假单胞菌(ATCC 9027)由天津工业微生物研究所赠送。对照培养基购自中国食品药品检定研究院。胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基分别购自国内A、B、C以及国外D和E共5个厂家。玫瑰红钠培养基及控制菌增菌、分离培养基均购自国内A、B和C三个厂家。

2 试验方法

2.1 理化性质测定

2.1.1 外观 观察干燥培养基及其配制并灭菌后的性状。

2.1.2 pH值测定 培养基按处方称取、配制；在高压灭菌前、后用pH计测定，重复3 次，结果以均值表示。

2.2 菌液制备 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌和乙型副伤寒沙门菌的新鲜培养物接种至胰酪大豆胨液体培养基中，32.5 ℃培养24 h；取生孢梭菌的新鲜培养物接种至硫乙醇酸盐流体培养基中，32.5 ℃培养24 h；取白色念珠菌的新鲜培养物，接种至沙氏葡萄糖液体培养基中，22.5 ℃培养72 h。取上述七种菌的新鲜培养物各1 ml至9 ml 0.9%无菌氯化钠溶液中，采用梯度稀释法制成菌液浓度不大于100 cfu/ml的菌悬液。取黑曲霉的新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基中，22.5 ℃培养7 d后，加入5 ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的无菌氯化钠溶液，将孢子洗脱。然后，吸出孢子悬液1 ml至9 ml 含0.05%聚山梨酯80 的0.9%无菌氯化钠溶液中，采用梯度稀释法制成菌液浓度不大于100 cfu/ml的黑曲霉孢子悬液。

2.3 微生物计数培养基的回收率测定

2.3.1 需氧菌总数计数 取金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌菌悬液各1 ml，注入平皿中，立即倾注胰酪大豆胨琼脂(TSA)培养基，每株试验菌各培养基平行制备2个皿，待培养基凝固后，置于培养箱中32.5 ℃培养72 h，计数菌落数，取平均值作为计数结果。

2.3.2 霉菌和酵母菌总数计数 取白色念珠菌和黑曲霉菌悬液各1 ml，注入平皿中，立即倾注沙氏葡萄糖琼脂(SDA)培养基。每株试验菌各培养基平行制备2个皿，待培养基凝固后，置于培养箱中22.5 ℃培养120 h，计数菌落数，取平均值作为计数结果。

2.3.3 回收率计算 将待测培养基计数结果与对照培养基计数结果相比，计算回收率比值。重复3次，取3次试验的的平均值作为回收率比值。

2.4 控制菌检查培养基的促生长能力、抑制能力和指示特性检查

2.4.1 培养基的促生长能力检查 取不大于100 cfu试验菌，接种至具有促进该菌生长的液体培养基或固体平板上，混匀或均匀涂布，置相应控制菌检查规定的培养温度，按规定的最短时间培养，观察试验菌在液体培养基上的生长状态或固体平板上的菌落大小和形态特征与对照培养基是否一致。

2.4.2 培养基抑制能力检查 取不小于100 cfu试验菌，接种至具有抑制该菌生长的液体培养基或固体平板上，混匀或均匀涂布，置相应控制菌检查规定的培养温度，按规定的最长时间培养，观察试验菌是否生长，与对照培养基是否一致。

2.4.3 培养基指示特性检查 取不大于100 cfu试验菌，接种至被检培养基上，均匀涂布，置相应控制菌检查规定的培养温度，按规定的最短时间培养，观察试验菌生长的菌落大小、形态特征、指示剂反应情况等与对照培养基是否一致。

2.5 溴化十六烷三甲铵琼脂培养基对铜绿假单胞菌的促生长能力试验 分别取不大于100 cfu铜绿假单胞菌CMCC(B) 10104和ATCC 9027，涂布至溴化十六烷三甲铵琼脂培养基平板上，置32.5 ℃恒温箱中培养，分别于18 h和48 h观察菌落形态和色素产生状况。于培养48 h时取整体完整、无重叠的菌落20个测量菌落直径并计算平均值，不取直径大小明显异常的菌落个体。

2.6 甘露醇氯化钠培养基对大肠埃希菌的抑制能力试验 取不小于100 cfu大肠埃希菌[CMCC(B)44102](分别约为102、104和106，体积不大于0.2 ml)，涂布至甘露醇氯化钠琼脂平板上，置32.5 ℃恒温箱中培养，每隔24 h观察结果，直至培养72 h。挑取甘露醇氯化钠琼脂平板上生长菌落至胰酪大豆胨琼脂平板上，32.5 ℃培养18 h后，采用VITEK2生化鉴定仪进行鉴定。

3 结果

3.1 培养基外观、pH等一般性状 各品牌培养基的外观性状均符合要求。以计数培养基为例，外观性状和pH值(按照处方进行配制灭菌后，未进行调节)列于表1。结果表明，国外D品牌和国内A品牌均为颗粒状，可以避免称量和配制时粉末对实验人员的危害。其余品牌均为粉末，溶解略快。各培养基灭菌后透明度、硬结度等物理指标均良好。培养基的pH值对微生物生长至关重要，过高或过低均影响微生物的生长状态。试验结果表明，个别厂家生产的培养基直接进行高压灭菌后的pH值需要进行调节，否则不符合要求。灭菌后需要进行pH值调节的培养基名称、厂家和对应pH值分别为：SDA培养基-对照-5.2，SDA培养基-A厂家-5.2，麦康凯琼脂培养基-对照-6.7，SDB培养基-A厂家-5.1，麦康凯液体培养基-C厂家-7.0，三糖铁琼脂培养基-C厂家-7.1。玫瑰红钠培养基用于真菌测定，一般略偏酸性，《中国药典》2015 年版未对其pH 值进行明确规定。

3.2 微生物计数培养基的回收率测定结果 计算待测培养基与对照培养基上菌落数的回收率比值列于表2。结果显示，五个厂家的胰酪大豆胨琼脂培养基和沙氏葡萄糖琼脂培养基的回收率比值在0.77～1.70之间，三个厂家的玫瑰红钠培养基回收率比值均在0.96～1.14之间，均符合《中国药典》0.5～2.0的要求。

3.3 控制菌检查培养基促生长能力、抑制能力和指示特性检查试验结果 采用选择性培养基对控制菌进行初筛，再针对疑似菌进行鉴定，有助于简化实验操作，提高工作效率，选择性培养基的质量直接影响了结果判定和检验效率。本文对14种控制菌检查用培养基的评估结果显示，2种培养基存在质量问题：B厂家溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基不能在最短培养时间使铜绿假单胞菌呈现典型色素特征；A、B、C三厂家的甘露醇氯化钠琼脂培养基均不能有效抑制大肠埃希菌。其余各培养基基本能满足对相应微生物的促生长能力、抑制能力或指示特性要求。

表1 计数培养基的一般性状和pH值

表2 不同厂家的微生物计数培养基回收率比值比较

3.4 溴化十六烷三甲铵琼脂培养基性能试验结果 在溴化十六烷三甲铵琼脂对照培养基上，铜绿假单胞菌[CMCC(B) 10104]呈现扁平，无定形，周边扩散，表面湿润，灰白色至蓝绿色，周围时有色素扩散。分别将铜绿假单胞菌接种至对照培养基、A、B和C各厂家的溴化十六烷三甲铵琼脂培养基上，其培养特征如表3所示。A厂家菌落特征和色素颜色与对照培养基类似，菌落直径更大。B厂家培养至18 h时无色素产生，48 h观察部分菌落有深蓝色色素产生，与对照培养基及其他厂家均有较大区别。C厂家菌落色素偏向黄绿色，且随培养时间延长色素产生逐渐增多。因此，据上述培养特征可以得出，按照《中国药典》要求进行溴化十六烷三甲铵琼脂培养基的促生长能力检查，培养最短时间(18 h)后，B厂家尚无色素产生，C厂家则色素颜色与对照培养基差别较大。使用铜绿假单胞菌ATCC 9027进行上述试验，具有相似的形态特征及色素颜色。

3.5 甘露醇氯化钠琼脂培养基对大肠埃希菌的抑制能力试验结果 甘露醇氯化钠琼脂培养基含7.5%氯化钠，具有较高渗透压，可以抑制大多数非葡萄球菌，如大肠埃希菌。但是在A和B厂家的该种培养基上涂布102cfu大肠埃希菌后，48 h内均可以生长，且均呈现黄色菌落，周围培养基变黄的现象，与金黄色葡萄球菌十分相似。挑取生长的疑似菌经染色镜检为革兰阴性杆菌，VITEK2生化鉴定仪鉴定确为大肠埃希菌。表明大肠埃希菌可以在A和B厂家的甘露醇氯化钠培养基上生长，均不符合《中国药典》要求。分别涂布不同浓度的大肠埃希菌至三个厂家的甘露醇氯化钠琼脂培养基，培养结果见表4。接种的大肠埃希菌在102～104之间时，对照培养基培养72 h内无菌生长，符合《中国药典》要求；当接种菌浓为106，则大肠埃希菌可能生长。C厂家可以抑制102大肠埃希菌，但接种104或106菌株时，随培养时间延长出现菌株生长。A厂家和B厂家接种102大肠埃希菌时，分别在48 h内和72 h即可生长，不符合要求。与厂家沟通后，B厂家进行改良得到的新产品B’，具有良好的选择性，试验结果符合要求。

表3 铜绿假单胞菌[CMCC(B) 10104]在不同生产厂家的溴化十六烷三甲铵琼脂培养基上的培养特征

注：产色素/比例是指菌落颜色、有无色素扩散/产色素菌落数与总菌落数的比值×100%。

表4 不同生产厂家的甘露醇氯化钠 琼脂培养基对大肠埃希菌的抑制能力考查

注：+表示有菌生长；-表示无菌生长；+(-)表示三次试验中有两次有菌生长，一次无菌生长。

4 讨论

4.1 本试验共对对照培养基及5个厂家共18种培养基进行适用性检查，发现3个厂家6种培养基直接灭菌后的pH值不在《中国药典》要求范围内，需要进行调整；2种培养基的微生物学性能不符合规定。国外D品牌和国内A品牌均为颗粒状，可以有效减少称量和配制时的粉尘污染，保护实验人员，是未来发展趋势。各培养基灭菌后透明度、硬结度等物理指标均良好。个别培养基在高压灭菌后颜色区别较大，如肠道菌增菌液体培养基(对照和C厂家为黄绿色；A和B厂家为蓝绿色)和RV沙门菌增菌液体培养基(对照、A和B厂家为蓝色；C厂家为蓝绿色)，可能与原料来源不同有关。

4.2 按照《中国药典》2015年版各培养基配制和微生物培养要求，核查三个厂家检验报告显示，在厂家进行质量控制的过程中存在结果表达方式与《中国药典》不一致、培养温度错误、促生长能力检查培养时间过长或抑制能力检查培养时间过短的问题。例如C厂家计数培养基出厂检验报告微生物检查中，接种<100 cfu试验菌株于特定条件下培养后，促生长能力显示为“生长良好”。这与《中国药典》要求“被检固体培养基上的菌落平均数与对照培养基上的菌落平均数的比值在0.5～2范围内”不一致，建议其进行修改。培养温度和时间会显著影响微生物的生长状态和特征，进一步反应培养基质量，因此建议生产厂家在质量检查过程中严格控制上述因素。

4.3 微生物性能是培养基质量的间接反映。比较计数培养基回收率，结果表明各品牌培养基的回收率在0.77～1.70之间，且国内品牌和国外品牌并无明显区别，说明国产计数培养基质量较为满意。选择性分离培养基是根据某类微生物的特殊营养需求，或其对某化学或物理因素特殊反应而设计的培养基，能够支持特定微生物生长并产生特定现象，而抑制其他微生物生长。因此，对选择性分离培养基的质量考查需要包含目标菌的生长率、特异性及非目标菌的选择性三个方面。相应地，《中国药典》2015版分别规定了固体培养基的促生长能力、指示性能和抑制能力的考查方法。但试验发现仍存在不适用状况，如不同厂家的甘露醇氯化钠琼脂培养基对不同浓度的大肠埃希菌抑制性能差别很大。《中国药典》仅规定接种不少于100 cfu的试验菌于被检培养基，并没有规定接种量的上限，导致被抑制微生物接种量不同时得到完全不同的试验结果。中华人民共和国国家质量监督检验检疫总局SN/T 1538.2-2007《培养基制备指南第2部分：培养基性能测试使用指南》要求非目标菌工作菌株悬浮液浓度在104～106cfu/ml，接种时采用3 mm接种环，根据生长情况计算G值，判断是否符合要求。

中华人民共和国国家标准GB4789.28-2013《食品安全国家标准食品微生物学检验培养基和试剂的质量要求》规定使用1 μl接种环取工作菌悬液1环，按标准模式划线培养后计算G值，进行半定量测试。这基本实现了对非目标菌株的定量接种。因此，《中国药典》可以借鉴以上标准中的试验方法，针对选择性分离培养基进行非目标菌测试时进行接种量的限制，并根据不同培养基的选择性强弱不同对测试结果设定不同要求。杨美琴[4]等研究表明USP/EP的溴化十六烷三甲铵琼脂培养基配方较2010版ChP配方更合理，因此《中国药典》2015年版采用明胶胰酶水解物作为碳/氮源、维生素和生长因子，并增加了选择性抑菌剂溴化十六烷三甲铵，新配方保持了与USP/EP一致。其中溴化十六烷三甲铵作为一种季铵盐阳离子去污剂，可释放细菌细胞中的氮和磷，抑制非绿脓杆菌，氯化镁和硫酸钾能够促进绿脓色素和荧光素的产生[4]。试验发现，不同厂家的溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基上铜绿假单胞菌的大小、色素产生状况存在差别。不能在规定时间内形成典型菌落将影响样品中铜绿假单胞菌的检出，导致假阴性。

培养基的质量直接影响到微生物学试验结果。目前，各厂家依据《中国药典》给出的配方制售培养基，但由于原料和工艺的区别，导致pH值、澄清度等理化指标和微生物性能的差异。本研究结果显示，国内各厂家生产的培养基质量基本较为可靠，但是仍存在个别培养基pH值需要进行调整、控制菌检查用培养基微生物性能不达标的问题。因此，各实验室需要严格按照《中国药典》要求对购买的培养基进行质量验收，剔除不符合要求的培养基，保证试验结果的准确性。

1 中国药典[S].四部.2015：140-149

2 美国药典[S].38版.2015:106-120

3 欧洲药典[S].8.0版.2014:185-194

4 杨美琴，马仕洪，刘鹏，等.溴化十六烷基三甲胺琼脂培养基促生长能力的评价分析[J].药物分析杂志，2014，34(11)：2071-2075

2016-07-19

R927.1

A

1006-5687(2016)05-0018-05