P57免疫组化结合CEP17倍体分析在葡萄胎鉴别诊断中的作用

陈永峰，薛 荣，刘 璇，陈云新，沈丹华

(1.乌鲁木齐市妇幼保健院病理科，新疆 乌鲁木齐 830001；2. 乌鲁木齐市妇幼保健院产前诊断中心，新疆 乌鲁木齐 830001；3.北京大学人民医院病理科，北京 100044)

P57免疫组化结合CEP17倍体分析在葡萄胎鉴别诊断中的作用

陈永峰1，薛 荣1，刘 璇2，陈云新3，沈丹华3

(1.乌鲁木齐市妇幼保健院病理科，新疆 乌鲁木齐 830001；2. 乌鲁木齐市妇幼保健院产前诊断中心，新疆 乌鲁木齐 830001；3.北京大学人民医院病理科，北京 100044)

目的 探讨P57免疫组化结合CEP17倍体分析在葡萄胎鉴别诊断中的意义。方法 收集乌鲁木齐市妇幼保健院病理科45例完全性葡萄胎，25例部分性葡萄胎及25例水肿性流产标本，运用免疫组化进行P57检测和FISH技术进行CEP17的倍体检测。进一步分析P57免疫组化结合CEP17倍体分析在葡萄胎鉴别诊断中的意义。结果 P57蛋白在部分性葡萄胎和水肿性流产组织中主要分布在绒毛的细胞滋养细胞和间质细胞中，阳性表达比例分别为100%(25/25)和100%(25/25)；但在绝大部分完全性葡萄胎中滋养细胞和间质细胞中P57表达缺失。P57在完全性葡萄胎中的阳性表达率为4.4%(2/45)，与部分性葡萄胎(χ2=61.9，P<0.05)和水肿性流产比较(χ2=61.9，P<0.05)，存在统计学差异。FISH分析结果显示：在水肿性流产中90.9%病例为CEP17二倍体(20/22)；部分葡萄胎中87.0%病例为CEP17三倍体(20/23)；在完全性葡萄胎中97.7%的病例为CEP17二倍体(42/43)。统计学分析结果显示：部分性葡萄胎三倍体的发生率明显高于水肿性流产(χ2=27.3，P<0.05)及完全性葡萄胎(χ2=49.6，P<0.05)。结论 P57免疫组化结合CEP17倍体分析对完全性葡萄胎，部分性葡萄胎和水肿性流产的鉴别诊断中具有重要的作用。

葡萄胎；流产；免疫组织化学；CEP17倍体分析

葡萄胎(hydatidiform mole, HM)按照病理学特征可以分为：完全性葡萄胎(complete hydatidiform mole, CHM)和部分性葡萄胎(partial hydatidiform mole, PHM)。由于完全性葡萄胎和部分性葡萄胎均有一定可能进展为滋养叶细胞肿瘤，特别是完全性葡萄胎，因而在日常的病理诊断工作中有必要将CHM和PHM准确的区分开。水肿性流产(hydropic abortuses, HA)组织病理学中表现为绒毛轻度水肿，但其滋养细胞增生不明显。由于超声技术的不断发展，可以发现早期葡萄胎，但由于葡萄胎早期的形态学特征不典型，病理诊断区分困难，如何正确的诊断这三种妊娠性疾病类型尤为重要，同时迫切需要寻找一些特有的标志物以辅助诊断[1]。

目前国内外的研究证实，细胞周期抑制因子和肿瘤抑制基因P57对于完全性葡萄胎和部分性葡萄胎起到了重要的鉴别作用[2]，但仍然有少数病例P57表达不典型，难以诊断，因而仍需要开发适用于病理科检测的方法或技术。近年来，免疫组化和FISH(fluorescence in situ hybridization)检测技术在国内、外的应用已相对广泛，国外有研究运用P57结合HER-2(human epidermalgrowth factor receptor-2)基因检测辅助葡萄胎的鉴别诊断，具有一定临床意义[3]，但由于HER-2基因在完全性葡萄胎中有一定扩增，有时会影响结果的判断。在本研究中采用P57免疫组化联合17号染色体FISH检测，观察其在葡萄胎鉴别诊断中的价值，希望能为病理诊断及临床治疗提供一些指导。

1材料与方法

1.1临床资料

收集新疆乌鲁木齐市妇幼保健院病理科2000年至2015年间临床及病理形态学上明确诊断的完全性葡萄胎、部分性葡萄胎、水肿性流产各45、25、25例，所有病理切片及相应免疫组化均经两位具有经验的病理学医师复诊。年龄在20～45岁之间。

1.2方法

组织标本经4%中性甲醛固定，石蜡包埋，常规4μm切片。常规HE及使用免疫组织化学Envision法检测P57的表达水平，实验操作完全按照试剂盒说明书进行，鼠抗人P57单克隆抗体购自Invitrogen公司。运用HER2/CEP17 FISH试剂盒进行CEP17染色体倍体检测。PathVysion Her2/CEP17 FISH双色探针和试剂购自美国雅培Vysis公司，并按其提供的说明书进行操作。

1.3免疫组化和FISH结果判定

免疫组化结果由两位主治以上的病理医师进行交叉双盲判定。P57免疫组化结果判断参照Legallo等[3]之前文献中报道的方法：细胞核呈现明显棕黄色着色可判读为阳性。在一张免疫组化切片中，如果绒毛间质细胞和细胞滋养细胞着色细胞数比例>10%，即可判定为阳性；如果若绒毛间质细胞和细胞滋养细胞没有着色或者散在着色，其着色细胞数比例<10%，则可判定为阴性。FISH判读同样参照Legallo的判断标准：在荧光显微镜下观察50个细胞滋养叶细胞及绒毛间质细胞，如果细胞核中CEP17绿色信号超过10%出现3个信号，可以判断为三倍体；同理判断二倍体和多倍体。

1.4统计学方法

所有的数据均采用SPSS 10.0软件进行卡方检验分析。组间比较使用卡方分割进行检验，以P<0.05设定为差异性有统计学意义。

2结果

2.1完全性葡萄胎、部分性葡萄胎和水肿性流产的组织病理学特点

从组织形态学HE切片中，可以看到水肿性流产仅见绒毛间质轻度水肿；部分性葡萄胎绒毛间质轻度水肿，可见有水池和滋养细胞包涵体形成，同时伴有绒毛周围滋养细胞的局灶性增生；完全性葡萄胎绒毛间质水肿明显并有水池形成，同时伴有明显的滋养叶细胞增生，见图1～图3。

2.2 P57蛋白在完全性葡萄胎、部分性葡萄胎和水肿性流产中的表达情况

从P57免疫组化结果中，可以看到部分性葡萄胎(图1)和水肿性流产(图2)的绒毛间质细胞和细胞滋养细胞的细胞核中表达呈弥漫阳性，但在绝大部分完全性葡萄胎绒毛间质细胞和细胞滋养细胞的细胞核中(图3)表达阴性。其阳性表达情况：45例CHM中2例(4.4%)呈阳性表达；25例PHM及HA中均呈阳性表达(100%)。P57在完全性葡萄胎中的阳性表达率为4.4%(2/45)，与部分性葡萄胎(χ2=61.9，P<0.05)和水肿性流产比较(χ2=61.9，P<0.05)，存在统计学差异。

Fig．1P57waspositiveforcytotrophoblastcells inHA(Envision，×200)Fig．2P57waspositiveforcytotrophoblastcellsinPHM(Envision，×200)Fig．3P57wasnegativeforcytotrophoblastcells(left)inCHM(Envision，×200)

2.3 CEP17在完全性葡萄胎、部分性葡萄胎和水肿性流产中的倍体分析结果

在水肿型流产、部分性葡萄胎及完全性葡萄胎中分别有3例、2例及2例，由于FISH信号较弱或无信号，无法进行评价，剔除出本研究。因而FISH分析结果显示：在水肿性流产中90.9%病例为CEP17二倍体(20/22)(图4)，9.1%的病例为CEP17三倍体，这2例CEP17三倍体的病例结合临床将诊断结果修正为部分性葡萄胎；部分葡萄胎中87.0%病例为CEP17三倍体(20/23)(图5)，13.0%的病例为CEP17二倍体，这3例为二倍体的病例结合临床将诊断结果修正为水肿性流产；在完全性葡萄胎中97.7%的病例为CEP17二倍体(42/43)(图6)、2.3%病例为CEP17 四倍体(1/43)。统计学分析结果显示：部分性葡萄胎三倍体的发生率明显高于水肿性流产(χ2=27.3，P<0.05)及完全性葡萄胎(χ2=49.6，P<0.05)。

Fig．4CEP17(green)wasdiploidin HA(FISH，×1000) Fig．5CEP17(green)wasdiploidinPHM (FISH，×1000)Fig．6CEP17(green)wasdiploidinCHM (FISH，×1000)

3讨论

目前临床上对于完全性葡萄胎、部分性葡萄胎和水肿性流产的诊断依然主要采用常规的HE染色，从各自的病理特征来鉴别，但是在妊娠前3个月病变未充分发展，形态学改变并未太明显时，病理诊断很难区分，但三者的临床处理及预后仍然具有一定差异，因此三者的准确诊断对于临床处理具有比较重要的影响。尽管有一些新的技术如STR的出现，但是由于设备和技术条件的限制，很难广泛开展。本研究选择病理科容易开展的P57结合CEP17倍体分析，探讨其在葡萄胎鉴别诊断中的意义。

3.1 P57蛋白在HA、 PHM和CHM鉴别诊断中的作用

P57是细胞周期抑制因子和肿瘤抑制基因，是父系印迹母系表达的基因。完全性葡萄胎不含有母方的DNA，所以在大多数的完全性葡萄胎中P57不表达，然而部分性葡萄胎和水肿性流产其DNA来自父母双方，故P57呈现阳性表达[2]。近年来的一些研究结果都进一步支持了P57免疫组化在鉴别完全性葡萄胎和部分性葡萄胎及水肿性流产中具有重要价值[4-5]。在本研究中，P57在PHM和HA中阳性表达均为100%和100%；而在CHM中表达较低，仅为4.4%，CHM中P57蛋白的阳性表达率明显低于PHM及HA，存在显著的统计学差异(P<0.05)，本研究结果也提示P57对于鉴别完全性葡萄胎和部分性葡萄胎及水肿性流产具有重要价值，但其对于部分性葡萄胎和水肿性流产的鉴别诊断无明显的意义。在本研究中同时发现，有2例CHM仍然有大于10%的细胞P57表达阳性，Crisp 等(2003年)的研究说明，P57基因属于不完全性印迹基因，虽然主要表达在母系等位基因上，但在父系等位基因中也会有少量的表达。这在日常诊断工作中需要引起注意，不能将其诊断为PHM，如果有条件还是建议进行倍体分析。本研究将这2例经FISH检测后均为二倍体，结合FISH结果支持CHM的诊断。

3.2 CEP17倍体分析在HA、PHM及CHM鉴别诊断中的作用

从葡萄胎的遗传学特征来看，完全性葡萄胎的染色体基因组是父系来源，染色体核型为二倍体，其中90%为46,XX，其少数核型为46,XY。部分性葡萄胎核型常是三倍体80%为69,XXY，其余是69,XXX或69,XYY。根据这一原理，可以考虑运用染色体中心粒探针进行染色体倍体分析，从而协助部分性葡萄胎的诊断。Legallo等[3]研究提示，通过FISH技术检测HER-2的拷贝数，间接反映染色体的倍体信息。其利用FISH和细胞遗传学实验，对44例CHM、PHM和HA病例进行回顾性分析，发现HER-2 FISH和细胞遗传学检测倍体结果的符合率达到85%，并首次提出利用免疫组化P57结合HER2 FISH检测对CHM和PHM具有鉴别诊断的作用。由于HER-2基因位于17号染色体，这一研究初步提示运用17号染色体着丝粒探针有可能对葡萄胎的倍体分析具有重要作用。由于葡萄胎可能有HER-2基因的扩增，相比而言，运用CEP17进行倍体分析结果更稳定。本研究通过FISH方法检测CHM、PHM和HA中细胞滋养细胞和绒毛间质细胞的倍体信息，结果显示在水肿性流产中90.9%病例为CEP17二倍体(20/22)，9.1%的病例为CEP17三倍体，这2例CEP17三倍体的病例结合临床将诊断结果修正为部分性葡萄胎；部分葡萄胎中87.0%病例为CEP17三倍体(20/23)，13.0%的病例为CEP17二倍体，这3例为二倍体的病例结合临床将诊断结果修正为水肿性流产；在完全性葡萄胎中97.7%的病例为CEP17二倍体(42/43)、2.3%病例为CEP17 四倍体(1/43)，这1例四倍体可能与精子染色体的复制有关。从这一结果可以初步看出，CEP17的倍体分析对部分性葡萄胎的诊断具有很好的敏感性，一般均为三倍体；完全性葡萄胎一般均为二倍体，个别可见四倍体；对于水肿性流产一般均为二倍体。当然，需要注意的是必须以组织学为前提及结合临床，因为对于一些三体综合征也会出现CEP17三倍体，但不是葡萄胎[6]。

综上所述，P57结合CEP17倍体分析在葡萄胎的诊断中具有重要价值。P57阴性、CEP17二倍体支持完全性葡萄胎诊断；P57阳性及CEP17三倍体支持部分性葡萄胎诊断；P57阳性及CEP17二倍体支持水肿性流产的诊断。对于一些形态学较难鉴别的葡萄胎，结合P57免疫组化染色及CEP17倍体分析可进一步辅助葡萄胎的诊断，但是本研究病例数尚少，需要进一步积累数据进行验证。

[1]任力,侯朝晖,郭晓东,等.P57,P53,bcl-2,ki-67联合应用在葡萄胎诊断中的意义[J].现代生物医学进展,2013,13(7):1319-1322.

[2]陈云新,沈丹华,顾依群,等.P57和P53蛋白在水肿性流产及葡萄胎鉴别诊断中的作用[J].中华病理学杂志,2011,40(10):694-697.

[3]Legallo R D,Stelow E B,Ramirez N C,etal.Diagnosis of hydatidiform moles using p57 immunohistochemistry and HER2 fluorescent in situ hybridization[J].Am J Clin Pathol,2008,129(5):749-755.

[4]赵可,钱建忠,徐洪明.P57和P53在葡萄胎和水肿性流产中的表达及意义[J].中国妇幼健康研究,2013,24(6):822-823,826.

[5]Zheng X Z, Hui P, Chang B,etal.STR DNA genotyping of hydatidiform moles in South China[J].Int J Clin Exp Pathol,2014,7(8):4704-4719.

[6]郑兴征,吴秉铨,Buza N,等.辅助技术有助于葡萄胎的精确诊断及分型[J].中华病理学杂志,2015,44(1):15-20.

[专业责任编辑：张冠军]

Application of P57 immunohistochemistry and CEP17 ploidy analysis in differential diagnosis of hydatidiform mole

CHEN Yong-feng1, XUE Rong1, LIU Xuan2, CHEN Yun-xin3, SHEN Dan-hua3

(1.Department of Pathology; 2.Center of Prenatal Diagnosis, Urumqi Maternal and Child Health Hospital,XinjiangUrumqi830001,China; 3.DepartmentofPathology,PekingUniversityPeople’sHospital,Beijing100044,China)

Objective To investigate the significance of P57 immunohistochemistry and CEP17 ploidy analysis in differential diagnosis of hydatidiform mole (HM). Methods The tissues amples, including 45 cases of complete hydatidiform mole (CHM), 25 cases of partial hydatidiform mole (PHM) and 25 cases of hydropic abortuses (HA), were collected from Urumqi Maternal and Child Health Hospital. The P57 expression and CEP17 ploidy analysis were analyzed using immunohistochemistry and fluorescence in situ hybridization FISH techniques, respectively. The significance of combining P57 immunohistochemistry and CEP17 ploidy analysis in the differential diagnosis of HM was further explored. Results P57 protein expression in PHM and HA was mainly in villous cytotrophoblast cells and stromal cells, and their rates of positive expression were 100% (25/25). But P57 expression was absent in cytotrophoblast cells and stromal cells in most CHM, and the positive expression rate was 4.4% (2/45), which was statistically different from that in PHM and HA (χ2=61.9, bothP<0.05). FISH analysis showed that CEP17 was diploid of CEP17 in 90.9% HA cases. In PHM cases, 87.0% (20/23) showed triploid of CEP17, and in CHM cases, 97.7% (42/43) showed diploid of CEP17. Statistical analysis showed that the incidence of triploid in PHM cases was significantly higher than in HA cases (χ2=27.3,P<0.05) and CHM cases (χ2=49.6,P<0.05). Conclusion The combined analysis of P57 immunohistochemistry and CEP17 ploidy plays an important role in the differential diagnosis of CHM, PHM and HA.

hydatidiform mole (HM); abortion; immunohistochemistry;CEP17 ploidy analysis

2016-09-06

乌鲁木齐市科学技术局基金资助项目(Y141310055)

陈永峰(1973-)，男，主任医师，主要从事妇科病理临床研究。

10.3969/j.issn.1673-5293.2016.11.019

R737.33

A

1673-5293(2016)11-1353-04