不同宫颈病变组织中人乳头瘤病毒16型E5基因的研究*

2017-01-19 00:49杨嘉洁曹子洵梁开如左酌驰左凤琼
四川生理科学杂志 2016年4期
关键词:危型宫颈炎宫颈癌

杨嘉洁 曹子洵 梁开如 左酌驰 左凤琼

(1.成都树德中学,四川 成都 610031;2.四川省妇幼保健院,四川 成都 610031;3.四川大学华西基础医学与法医学院,四川 成都 610041)

不同宫颈病变组织中人乳头瘤病毒16型E5基因的研究*

杨嘉洁1曹子洵1梁开如2左酌驰1左凤琼3△

(1.成都树德中学,四川 成都 610031;2.四川省妇幼保健院,四川 成都 610031;3.四川大学华西基础医学与法医学院,四川 成都 610041)

目的:探讨人乳头瘤病毒(Human papillomavirus type,HPV)16型E5早期基因在临床宫颈炎、宫颈上皮内瘤变(Cervical intraepithelial neoplasia,CIN)Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型及宫颈癌患者中的存在情况,判断HPV16 E5是否能作为临床宫颈癌的早期诊断治疗靶点,以利进一步研究HPV16的致癌机制。方法:从临床标本中筛选出HPV16阳性标本61例,根据病理诊断分为5组(宫颈炎组、CINⅠ级、CINⅡ级、CINⅢ级及宫颈癌组),再应用PCR的方法分别测定各组组织中HPV16 E5 DNA的表达情况。结果:宫颈炎组E5 DNA阳性率为58.33%,CINⅠ级为63.64%,CINⅡ级为70.00%,CINⅢ级为44.44%,宫颈癌为77.78%,各组间阳性率差异无统计学意义。结论:E5 DNA不仅仅在宫颈癌早期存在,因而E5不能作为临床宫颈癌的早期诊断靶点,但可作为宫颈癌疫苗研究的靶点。

宫颈癌;人乳头瘤病毒(Human papillomavirus type,HPV)16;E5基因

宫颈癌是妇女最常见的恶性肿瘤之一,在全球妇女恶性肿瘤中,其发病率仅次于乳腺癌居第二位[1]。世界范围内,每年新发宫颈癌病例约50万,我国每年新发宫颈癌的病例约7.5万[2],且发病呈现年轻化趋势[3]。流行病学及分子生物学资料证实,人乳头瘤病毒(Human papillomavirus type,HPV)感染为宫颈癌发生的必要条件[4-6],特别是高危型HPV,是宫颈癌重要的致病因子[7]。有资料显示,宫颈癌病人HPV的阳性率为99.7%,其中约有一半的感染亚型为HPV16型[8]。在正常子宫颈由轻(CINⅠ)、中(CINⅡ)、重型(CINⅢ)子宫颈不典型增生到宫颈癌的进程中,HPV的感染促进了这个过程。HPV16刺激宫颈上皮细胞转化成肿瘤细胞与其3种早期癌蛋白E5、E6、E7的表达密切相关。国内外关于HPV16 E6、E7的研究较多,而E5的研究资料一直较少。以往的研究认为,肿瘤形成早期的阶段,E5的转录体及蛋白非常丰富,晚期肿瘤中的E5常因HPV16病毒整合至宿主细胞而缺失,但近年有研究认为并非所有晚期肿瘤病例均呈现HPV16单纯整合,还包括游离型与混合型[5,6],因此E5在晚期肿瘤细胞中可能同样表达。

本研究通过收集不同病变程度临床标本,系统研究在宫颈炎症、典型性增生(Ⅰ级、Ⅱ级、Ⅲ级)以及宫颈癌患者宫颈组织中HPV16 E5基因情况。通过分析,我们可获知临床HPV16感染宫颈病变中E5DNA的第一手资料,从而获知HPVE5是否可作为临床宫颈癌早期诊断的靶点,为临床宫颈癌的早期诊断和进一步研究其致癌机制打下坚实的基础。

1 材料与方法

1.1 临床标本

所有标本均采自于四川省妇幼保健院宫颈门诊。选取HPV16阳性的相应组织样本61份进一步进行E5基因的研究。根据临床病理诊断分别分为:宫颈炎组、CINⅠ级、CINⅡ级、CINⅢ级与宫颈癌组。

1.2 主要试剂

DNA提取试剂盒购自潮州凯普生物化学有限公司;Premix-Tag购自宝生物工程(大连)有限公司;DNA相对分子质量标志物DL2000购自北京天为时代科技有限公司。其它试剂为国产分析纯。

1.3 方法

1.3.1 组织标本中DNA的提取

采用凯普公司DNA提取试剂盒提取组织中病毒基因组DNA,操作按试剂盒说明书进行。

1.3.2 HPV16 E5 DNA的测定

1.3.2.1 HPV16E5引物的设计

根据GenBank中查得的东亚型HPV16全基因序列(基因登陆号:AF534061)设计扩增HPV16E5基因的上下游引物。上游引物:5′-GACAAATCTTGATACTGCATCCACA-3′,下游引物:5′-GACACAGACAAAAGCAGCGGAC-3′。扩增的片段大小为108 bp,为E5部分基因。内参为β-actin,上游引物:5′-CCACGAAACTACCTTCAACTCC-3′,下游引物:5′-GTGATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′,片段大小为132 bp。

1.3.2.2 HPV16 E5 DNA的测定

HPV16 E5 DNA的测定分为以下几个步骤:①PCR:扩增反应体系总体积为20 μl,包括 premix Tag10 μl,primer 0.5 μl,ddH2O 7.5 μl,组织DNA 2 μl。设置阴性对照。扩增条件为预变性95℃ 9 min,变性95℃ 30 sec,退火58℃ 30 sec,延伸72℃ 15 sec,共40个循环,后延伸72℃ 10min。②凝胶电泳:凝胶浓度为2.5%-3%,marker为DL2000,目标条带为108kb,电泳时电压为90 v,电泳时间为30 min。③结果判断:阴性对照无条带。样本处若相应位置(108 bp)出现目标条带,则为阳性结果,否则为阴性。

1.4 统计方法

利用EXCLE2010处理数据并建立数据库,SPSS16.0进行统计分析,采用Χ2检验,检验水准α设为0.05。

2 结果

2.1 组织样本中E5基因PCR扩增

以组织中提取的DNA为模板,以E5的特异引物进行进行PCR反应,PCR琼脂糖电泳结果见图1(部分结果)。可见,阴性结果无条带,阳性结果250 bp与100 bp之间有一明显条带,大小与预期值相符(108 bp)。内参β-actin PCR结果见图2,片段大小约为132 bp,与预期值相符。本实验中每一个样品β-actin PCR实验结果均为阳性,说明我们基因组DNA提取是完全成功的。

图1 PCR产物E5基因的琼脂糖电泳注:6,11:DNA marker(DL2000);10:阴性对照;1,5:PCR阴性结果;2-4,7-9:PCR阳性结果(108 bp)

图2 β-actin的琼脂糖电泳注:1-11:β-actin;12:DNA marker(DL2000)

2.2 不同宫颈病变组织中HPV16E5基因阳性率分析

在不同组别HPV16阳性的标本中检测到E5基因的情况可见:宫颈炎中E5基因阳性率为58.33%,宫颈癌组中E5基因阳性率为77.78%,宫颈癌组中阳性率最高,见表1。但经SPSS检验分析,各组间P>0.05,差异无统计学意义。HPV16 E5基因并不仅仅在宫颈癌早期表达。

表1 HPV16 E5DNA在不同病变宫颈组织标本中的阳性率

3 讨论

人乳头瘤病毒(HPV)有多种基因型,到目前已经发现了150多种,与人生殖道感染有关的有40多种,其中20种与宫颈癌的发生相关[9]。根据致癌危险性可将HPV分为低危型和高危型。低危型HPV主要引起生殖道湿疣及轻度的宫颈上皮内瘤变(CINⅠ),高危型HPV主要引起中、重度的宫颈上皮内瘤变(CINⅡ、CINⅢ)和宫颈癌。

HPV16是高危型病毒,其E5基因编码83个氨基酸的小蛋白。E5蛋白主要存在于细胞膜[10]、高尔基体、内质网膜及核膜中,有研究提示它主要在感染细胞的早期繁殖、扩张中起重要作用[11],但近年有研究认为E5在晚期肿瘤细胞中因HPV16基因并非单纯整合(还包括游离型与混合型)因此可能同样存在[5-6]。

Chang等[12]以免疫组化的方法,研究HPV16感染的不同宫颈病变组织发现,在低级的CIN和高级CIN病变组织中均有HPV16E5蛋白的表达,在侵入性宫颈癌中发现40%的样本中E5蛋白表达。

本研究中,宫颈炎组E5 DNA阳性率为58.33%,CINⅠ级为63.64%,CINⅡ为70.00%,CINⅢ级为44.44%,宫颈癌为77.78%,各组间阳性率差异无统计学意义,HPV16 E5基因并不仅仅在宫颈癌早期表达。该研究与我们推测的E5基因可能仅存在于宫颈病变的早期相反,但与Chang等研究结果相同,这也与胡家昌[10]等认为的晚期肿瘤病例中包括游离型与混合型HPV16,E5在晚期肿瘤细胞中可能同样存在的观点相吻合。E5基因在宫颈病变不同程度中均存在,且在宫颈癌晚期阳性率较高,提示我们可将HPV16E5作为宫颈癌疫苗研究的靶点之一。

1 Rob L, Halaska M, Robova H. Nerve-sparing and individually tailored surgery for cervical cancer[J]. Lancet Oncol, 2010, 11(3): 292-301.

2 吴斌,于晓红. HPV与宫颈腺癌研究进展[J]. 江西医药, 2015, 50(2): 180-182.

3 Zhang MJ, Katanoda K. Comparison of time trends in uterus cancer and cervix uteri cancer mortality (1990-2006) in the world, from the WHOmortality database[J]. Jpn J Clin Oncol, 2010, 40(1): 98-99.

4 Tommasino M. The human papillomavirus family and its role in carcinogenesis[J]. Semin Cancer Biol, 2014, 26(6): 13-21.

5 朱义保,谢彤,杨亮亮,等. 人乳头瘤病毒HPV16整合与宫颈病变程度的研究[J]. 实验与检验医学, 2015, 33(4): 395-398.

6 胡家昌,李芳. 高危型HPV DNA与宿主基因整合及致癌机理的相关研究进展[J].现代妇产科进展, 2015, 24(5): 384-386.

7 Bernard HU, Burk RD, Chen Z, et al. Classification of papillomaviruses (PVs) based on 189 PV types and proposal of taxonomic amendments[J]. Virology, 2010, 401(1): 70-79.

8 聂妹芳,李登清,黄民主,等. 11461例妇科门诊患者HPV亚型感染状况的研究[J].中国现代医学杂志, 2011, 21(27): 3434-3438.

9 Jung WW, Chun T, Sul D, et al. Strategies against human papillomavirus infection and cervical cancer[J]. J Microbiol, 2004, 42(4): 255-266.

10Hu L, Ceresa BP. Characterization of the plasma membrane localization and orientation of HPV16 E5for cell-cell fusion[J]. Virology, 2009, 393(1): 135-143.

11Fehrmann F, Klumpp DJ, Laimins LA. Human papillomavirus type 31 E5 protein supports cell cycle progression and activates late viral functions upon epithelial differentiation[J]. J Virol, 2003, 77(5): 2819-2831.

12Chang JL, Tsao YP, Liu DW, et al. The expression of HPV-16 E5 protein in squamous neoplastic changes in the uterine cervix[J]. J Biomed Sci, 2001, 8(2): 206-213.

Study on human papillomavirus type 16 E5 gene in different cervical lesions*

Yang Jia-jie1, Cao Zi-xun1,Liang Kai-ru2,ZuoZhuo-chi1, Zuo Feng-qiong2△

(1.Chengdu Shude High School, Sichuan Chengdu 610031;2.Sichuan Maternal and Child Health Hospital, Sichuan Chengdu 6100313;3.West China of Preclinical and Forensic Medicine, Sichuan University, Sichuan Chengdu 610041)

Objective:To investigate E5 gene of human papilloma virus (HPV)16 in clinical cervicitis, CIN I, CIN II, CIN III and cervical cancer patients;to determine whether HPV16 E5 can be used as early diagnosis target for clinical cervical cancer; to further study the mechanism of carcinogenesis of HPV16. Methods: Sixty-one cases were selected from HPV16 positive specimens which were divided into 5 groups according to the pathological diagnosis (cervicitis group, CIN I, CIN II, CIN III and cervical cancer group). HPV16 E5 DNA was measured by PCR. Results: The positive rate of DNA E5 was 58.33% in cervicitis group, 63.64% in CIN I, 70% in CIN II, 44.44%in CIN III, and 77.78% in cervical cancer. Between groups the positive rate was not statistically significant. Conclusion: DNA E5 not only exists in the early stage of cervical cancer, so E5 cannot be used as a target for early diagnosis of cervical cancer, but it can be used as a target for cervical cancer vaccine research.

Cervical cancer; Human papillomavirus type 16; E5 gene

四川省科技厅基金(编号:2012JY0017)

杨嘉洁,女,成都树德中学高2015级学生,Email:397480785@qq.com。

△通讯作者:左凤琼,女,高级实验师,主要从事医学微生物学与免疫学教学及科研工作,Email:497465261@qq.com。

2016-11-1)

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