人类胚胎植入前诊断的研究进展

韩瑞钰 马 婧 王树松

河北省计划生育科学技术研究院，国家卫计委计划生育与优生重点实验室(石家庄，050071)

·综 述·

人类胚胎植入前诊断的研究进展

韩瑞钰 马 婧 王树松*

河北省计划生育科学技术研究院，国家卫计委计划生育与优生重点实验室(石家庄，050071)

植入前遗传学诊断(PGD)是在人类辅助生殖技术的基础上筛选无染色体异常的胚胎，诊断并选择未见遗传缺陷的胚胎植入子宫，帮助妊娠成功、减少出生缺陷[1]。1990年一对X-性连锁疾病夫妇通过PGD诞下一名健康女婴[2]，标志着PGD走入临床应用阶段。PGD主要适用于携带遗传性疾病、遗传风险或染色体重排的夫妇[3]，还可应用于反复胚胎种植失败等一些基因突变的疾病、迟发型疾病、HLA配型等[4]。本文对人类胚胎植入前诊断的研究进展及前沿进行综述。

1 现阶段PGD的主要技术

1.1 活检技术

PGD活检取材主要来源包括极体活检、卵裂球活检以及囊胚期胚胎活检[5]。极体活检主要检测胚胎来自母源性的遗传信息，不会因为细胞嵌合体而产生误诊风险，对胚胎发育影响较小，后续对采集的极体细胞可进行遗传诊断的时间长。卵裂期活检是早些时候应用广泛的活检方法，在卵子受精第3天发育至6～8个细胞的卵裂球进行活检。近年来囊胚期胚胎活检成为主流，在受精后第5天取滋养外胚层细胞进行检测，可取得更多的细胞进行分析，且胚胎嵌合体发生率较低。但缺点在于它还不是胎儿本体的真正代表，染色体异常比例大[6]，容易造成误诊。

1.2 诊断技术

1.2.1 荧光原位杂交(FISH)技术 此技术是用基因或染色体片段的特异性探针进行荧光标记，1994年应用于胚胎性别诊断，此后FISH被用于间期核进行非整倍体筛查[7]。FISH技术简单、快速，精确率有所提高，但仍存在一些问题，如 FISH检测染色体的数目如何增加，如何提高探针的联合使用效率，不同植入前筛查指征患者如何选择FISH探针组合等仍存在争议。

1.2.2 比较基因组杂交(CGH)技术 CGH原理是用不同颜色的荧光染料标记DNA进行荧光强度对比分析。该方法可分析所有染色体的数目、各位点遗传物质，但不能检出多倍体、DNA序列的微缺失、点突变及低拷贝的扩增，也不能检出平衡易位等染色体畸变。

1.2.3 微阵列技术 目前常用的技术为微阵列比较基因组杂交技术(array CGH)，可检测全部染色体，且准确、快速[8]。有研究显示，array CGH技术比FISH技术可更多检测出染色体畸形和异常胚胎[9]。array CGH联合囊胚期活检方法被建议作为PGD中检测全部染色体非整倍体的优先选择方法[10]。另单核苷酸多态性array技术作为微阵列技术方法之一，可用于检测非整倍体、部分单基因遗传病[11]，并且可以提供胚胎的DNA图谱[12]。

1.2.4 单核苷酸多态性(SNP)芯片 SNP芯片通过对比位点、荧光强度来诊断染色体。可同时分析每个胚胎遗传信息的DNA指纹，用于鉴别胚胎的遗传性状。SNP 可自动化分析，分辨率和准确性高；可以判断缺失、重复的亲源和单体二体性，但区分正常和平衡易位仍有难度。在PGD应用中，通过SNP技术进行胚胎植入前检测比FISH方法检测临床妊娠率高、流产率低[13]。CGH芯片和NGS技术相比SNP较为经济、性价比高，应用相对较多。近几年在诊断单基因疾病以及染色体异常方面, 应用二代测序、全基因组扩增等在PGD诊断中逐渐增多，更多的新技术也在研发中[14]。

1.2.5 第二代测序(NGS)技术 第二代测序与一代测序相比增加了通量、降低了成本、提高了速度，为同时分析单基因病和进行全面染色体诊断提供可能[15]。随着第二代测序的快速发展，作为基因检测的金标准将成为PGD主流[16-17]，在全球基因测序市场上占有着绝对优势。

1.2.6 全基因组扩增(WGA) WGA是对所有基因组序列进行非选择性扩增，使DNA总量在最小偏倚下得到大幅度增加，最大限度增加遗传信息量，用微量DNA分析多基因位点以及重复检测。对于PGD活检取材少或只有单个细胞来说，WGA具有操作简单、产量多且稳定、扩增效率高、高保真性，扩增片段长度长等特点。

2 无创性检测技术是未来PGD发展趋势

2.1 传统PGD面临的挑战

在近20年的发展中，随着囊胚活检技术的规范、胚胎玻璃化冷冻技术的成熟以及单细胞全基因组遗传学检测技术的应用和分子遗传学诊断技术的涌入，PGD应用范围不断扩大。因此，传统PGD的安全性开始受到关注，从对技术本身的认识到临床应用也逐渐趋于客观和理性。

2.1.1 安全获取胚胎遗传物质 安全的获得胚胎遗传物质避免胚胎损伤，是PGD面临的挑战之一。胚胎的细胞活检是PGD的主要内容之一，主要分为透明带开孔和胚胎活检。激光法由于更加简便、快速和精准，成为目前各生殖中心比较公认的透明带开孔技术。但是激光束对胚胎带来的热效应影响了细胞的分化和发育值得关注，随后很多学者对活检物质的安全性进行了研究。Levin等[19]研究结果显示，与未活检的胚胎相比，极体活检的D2和D3胚胎卵裂率、胚胎碎片、胚胎细胞数和胚胎质量等均较差，极体的诊断效率低于卵裂球的诊断效率。Kirkegaard等[20]报道，经过卵裂球活检的胚胎形成桑葚胚、囊胚的时间明显延长，透明带厚度明显增加，形成囊胚的直径明显减少。这说明卵裂球活检对胚胎的后续分裂发育存在着影响。Scott等[21]的研究则更有代表性，他认为卵裂球活检的胚胎着床能力比未活检胚胎下降了39%，而在囊胚期活检滋养层细胞活检与未活检胚胎着床能力差别不大。囊胚的滋养层活检虽然可获得更多的细胞供诊断，嵌合率也显著降低，但囊胚的培养技术要求较高，或者卵裂球发育的自我淘汰，使得囊胚形成率现在只有40%左右。体外培养时间延长也可能对印记基因有一定的影响。另外胚胎植入子宫是要受内膜种植窗的时间限制，如果想避免胚胎冷冻或者冷冻技术不完全成熟， PGD诊断的时间要受到严格控制，此时囊胚可供诊断的时间较短。

2.1.2 子代发育安全 随着PGD子代的出生，其子代发育的安全性和生存质量越来越受到人们的关注。目前，流行病学调查研究的PGD子代年龄还局限于出生后2～5年，因此仍然缺乏大样本、前瞻性随机对照研究。Liebaers等[22]分析了581名PGD或PGS出生后的婴儿，发现在多胚胎妊娠中PGD组的婴儿围产期死亡率(11.73%)高于ICSI组(2.54%)。Schendelaar等[23]前瞻性研究表明，PGD、PGS虽然不影响4岁单胎儿童的神经系统、认知能力及生长发育，但接受辅助医疗护理(如语言训练、身体训练等)的比例高于对照组儿童；并且对于PGD、PGS双胎而言，其神经系统发育受到影响。虽然近来对PGD子代的流行病学调查研究未提示胚胎活检会影响行为发育，但是一些动物的PGD模型研究带给我们一些警示。在一组研究小鼠PGD模型活检后妊娠发育情况，显示PGD子代成年小鼠的神经退行性病变的几率增加。另外还有研究显示，胚胎活检对小鼠的肾上腺发育可能产生影响，从而改变小鼠对冷刺激的适应[24]。尽管这些模式动物研究从蛋白组学的角度认为PGD对子代安全性有影响，但能否说明会影响人类PGD子代的神经系统发育还需进一步研究。因此，对于PGD子代婴儿期至成年期的安全性仍要持续关注。

2.2 无创胚胎植入前筛查技术进展

胚胎植入前诊断为选择遗传学正常的胚胎进行移植提供了可行方法，但其面临着活检损伤、误诊率、子代健康、伦理等诸多问题，因此必须认识到PGD作为一项侵入性的技术，仍然是把“双刃剑”。鉴于未进行PGD的单胚胎移植的出生率较低以及传统PGD面临的挑战和安全性，目前胚胎学研究的方向倾向于探索更有效的无创评估体系来优选最具发育潜能的胚胎进行单胚胎移植。近几年来，代谢组学分析、形态学分析以及无创胚胎染色体筛查技术通过无创伤性方式进行胚胎植入前检测已成为PGD技术的发展趋势。

2.2.1 胚胎代谢组分析 胚胎代谢与胚胎活力有关，通过检测胚胎培养液中的代谢物和分泌物再结合胚胎评估方法来优选高潜能的胚胎,甚至还可以洞察到胚胎表现型。胚胎代谢物主要包括丙酮酸[25]、葡萄糖[26]、脂肪酸[27]、氨基酸[28]等，随着胚胎培养体系的发展，通过对这些物质的摄入量及代谢进行分析可能挑选出具有发育潜能的胚胎。Sakkas等[29]研究发现优质的囊胚摄取的葡萄糖量较劣质的多；Brison等[30]对胚胎培养液中氨基酸的改变研究发现，甘氨酸、亮氨酸水平降低而天冬氨酸水平升高可能代表胚胎的代谢情况。这种改变有助于提高临床妊娠率和活产率。有学者[27]用气相色谱分析培养液中脂肪酸的代谢, 显示4细胞以上的胚胎相比4细胞以下胚胎其不饱和脂肪酸浓度升高,而饱和脂肪酸浓度降低,说明植入前胚胎生长代谢需要脂肪酸的存在。培养液代谢物检测胚胎活力以其简单无创的优点成为研究的热点，应用最为广泛的检测技术包括光谱分析、质谱联用和磁共振等技术。2002年Houghton等[28]通过高效液相色谱法来分析不同阶段的胚胎氨基酸的代谢和摄入量与囊胚形成的关系，发现一些特定氨基酸的含量变化直接影响着囊胚的形成。2007年，Seli等[31]首次用拉曼光谱技术对受精后第1～3天的胚胎培养液分析，预测胚胎种植的灵敏度为75%，特异性为83.3%。2008年Seli等[25]用1H-NMR技术显示培养液中高谷氨酸水平与临床妊娠率和活产率有关。代谢组学作为一种新兴的技术与方法，通过分析胚胎培养液中各种成分的改变来判断胚胎的代谢和发育潜能，还可以检测由于细胞破损而泄露的代谢物等[32]，能够客观、无创、全面地反映胚胎的生长发育情况，可作为无创胚胎质量评估系统的内容之一。

2.2.2 胚胎形态学分析 近年来，胚胎的形态学评估被普遍应用于各个生殖中心，并且提出许多胚胎的评估动态观察指标，主要包括胚胎的分裂速度、卵裂球发育的同步性、碎片的量等参数。一些回顾性研究也证明了妊娠结局与胚胎动态指标之间存在相关性。时差成像系统(TLI)是近年来发展的一种新的胚胎质量影像评估体系，能自动捕捉胚胎发育各个阶段的形态以及发育发生的特定时间并将其合并成动态影像，包括从受精卵到卵裂期胚胎或囊胚的一系列生物学变化，与胚胎发育潜能有着密切的关系[33]，从而为临床上胚胎的筛选提供更多信息，以提高临床妊娠率。Payne等[34]研究表明,从ICSI注射后到双原核(2PN)相互靠近的间隔时间与胚胎质量相关,质量好的胚胎较质量差的胚胎间隔时间较短。2008年Lemmen等[35]研究表明原核消失时间早的胚胎发育潜能更好，优质胚胎的原核消失时间应该是在受精后20h45min～25h之间。Meseguer等[36]研究表明最佳时间范围内卵裂的胚胎与此时间范围之外发育的胚胎相比较,其着床率明显较高。一套非侵入性早期胚胎活力评价系统(EEVA)已经开发，相关研究人员希望这套系统能够成为一项无创胚胎质量评价技术，用这些新的发育行为学指标帮助技术人员更有效的评价胚胎质量，并在临床上取得良好的应用。

2.2.3 胚胎游离DNA检测 Capalbo等[37]报道即使是形态学最高级别的囊胚也只有56%的染色体整倍体率。因此，对胚胎进行遗传学分析和诊断是去除遗传缺陷胚胎，选择诊断正常胚胎植入子宫的唯一趋势和方法，甚至可以提高妊娠率。因此，对培养液中胚胎来源的游离遗传物质进行富集及遗传分析来诊断胚胎染色体非整倍体疾病是目前唯一一种没有侵入性的胚胎遗传学诊断和分析技术。在2013年Poli等[38]就在囊胚期胚胎腔中发现了游离的核DNA引起了更多学者的研究， Magli等[39]通过对51对夫妇的116枚胚胎同时进行了囊胚腔液检测及胚胎细胞活检，检测结果分析显示囊胚腔液游离DNA检测能够很好的反应胚胎染色体的状态。在2013年， Stigliani等[40]发现人卵裂期胚胎培养液中存在基因组DNA(gDNA)和线粒体DNA(mtDNA)，其mtDNA含量同胚胎发育水平、囊胚的形成及形态等具有相关性，培养液中mtDNA/gDNA值与胚胎质量和片段化程度相关。他们进一步研究发现，胚胎3天培养的培养液中，mtDNA/gDNA增高与胚胎的优选和移植率密切相关[41]。虽然这种DNA的存在还不能完全肯定其来源，但是如果作为胚胎来源的遗传物质，通过分析胚胎3天培养液中mtDNA/gDNA值，结合代谢组学以及形态学的分级，有可能作为一种新的非侵入性胚胎优选指标，提高识别早期胚胎活力与发育潜力。Capalbo 等[42]在胚胎培养液中发现2种来源于滋养外胚层的miRNA，认为可以作为评价胚胎潜能的生物学标志物。随后，通过对培养液游离DNA的富集和基因组分析，在2014年一项研究显示[43]，通过胚胎培养液中游离DNA的分析可以鉴别胚胎性别从而阻断X-连锁遗传疾病的植入。2015年的一项研究通过胚胎培养液中游离DNA的检测，筛查出地中海贫血的单基因突变，认为这种检测方法可以发展无创性的PGD进行胚胎质量的评估和遗传病的筛查[44]。虽然目前对胚胎游离DNA的来源及释放机制尚不十分明确，另一方面游离DNA的低产量和较差的完整性也为其临床应用带来了挑战，在临床推广可能尚需要一段时日。但是通过一些前期的研究，无创性的植入前胚胎潜能评估系统早已证明了其存在价值，其临床需求正快速增加。

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[责任编辑：董 琳]

2016-09-29

2016-12-15

*通讯作者：wshsong@sina.com