饮料中柠檬黄含量测定方法的优化

□ 余方林 恒枫食品科技有限公司 包秀秀 杭州市食品药品检验研究院 严大迅 宏胜饮料集团有限公司

1 实验部分

1.1 仪器和试剂

仪器：Agilent1260高效液相色谱仪，配紫外检测器。

试剂：柠檬黄标准品（GBW(E)100001a）、乙酸铵（HPLC）、甲醇（HPLC）、冰醋酸（HPLC）、无水乙醇（HPLC）、甲酸（AR）、柠檬酸（AR）、氨水（AR），超纯水。

1.2 实验步骤

1.2.1 标准溶液配制和样品前处理

准确移取0.500 mg/mL的柠檬黄标准溶液用超纯水逐级稀释至1.0～50.0 μg/mL系列标准溶液，经0.45μm滤膜过滤后上机。

称取适量饮料样品至100mL烧杯内，加柠檬酸溶液调pH至3～4，60℃水浴10min。将1g聚酰胺粉加少许水调成粥状，倒入样品中，搅拌并水浴10 min，以沙芯漏斗过滤，用60℃ pH为3～4的水洗涤3～5次，用甲醇-甲酸混合溶液洗涤3～5次，再用水洗至中性，用乙醇-氨水-水混合溶液解吸3～5次，直至色素完全解吸，收集解吸液，加乙酸中和，蒸发至近干，加水溶解，定容至10 mL，经0.45μm微孔滤膜过滤后分析。

1.2.2 液相色谱条件

色谱柱：ZORBAX Eclipse XDB-C18（4.6 mm×150mm，5µm）。

流动相：A：0.02mol/LNH4AC，B：甲醇。（0-3 min：从95%A到65%A；3-7 min： 从 65%A到 0%A；7-10 min： 从0%A到 0%A；10-10.1 min： 从 0%A到95%A；10.1-21 min：维持95%A）。

流速 1.0mL/min； 进 样 量 10µL；柱温35℃；检测器1260DAD VL+ 检测器；检测波长254 nm、428 nm。

2 结果与讨论

2.1 不同检测波长比对

柠檬黄在254 nm和428 nm波长下均有最大吸收峰，因此考察了254 nm和428 nm波长下对检测结果的影响。结果表明，254 nm波长下的样品谱图杂峰较多，428 nm波长下的样品谱图峰干净，杂峰少。另外，直接进样在254 nm波长下的结果高于在428 nm时的结果，而用聚酰胺处理后的样品在254 nm和428 nm时的结果基本一致，说明直接进样的样品在254 nm处有杂质吸收，对柠檬黄的检测结果造成干扰，使结果偏高。因此，选择428 nm为检测波长。

2.2 pH值对聚酰胺吸附的影响

选择pH为3.75的饮料样品，考察了pH对聚酰胺吸附效果的影响，结果表明，将样品溶液pH调至6后，样品柠檬黄加标回收率为65.0%，而不调pH的样品柠檬黄的加标回收率高达92.8%，说明在pH为6的溶液环境下聚酰胺吸附柠檬黄的能力变弱。因此，选择将pH至3～4较为合适。

2.3 聚酰胺使用量对吸附的影响

在检测波长为428nm条件下，分别称取0.5、1.0、1.5 g聚酰胺对果汁饮料样品（pH值为3.75）进行吸附处理，考察聚酰胺的用量对吸附过程的影响。结果表明，当聚酰胺用量为1.0 g时，柠檬黄回收率最高，0.5 g次之，用量为1.5 g时加标回收率最低，说明聚酰胺用量过少时，对柠檬黄吸附能较弱，洗脱时柠檬黄易被洗脱出来导致结果偏低；聚酰胺用量过多时，吸附充分，部分柠檬黄残留在聚酰胺中，无法被完全洗脱也导致结果偏低。因此，选择聚酰胺用量为1.0 g。

2.4 微孔滤膜对吸附的影响

刘胜男等[1]认为使用微孔滤膜过滤对色素有吸附作用，使结果偏低。因此本文考察了微孔滤膜的使用对色素吸附的影响，结果表明，20 μg/mL与50 μg/mL标液过不过微孔滤膜得到的结果无显著变化，在本实验条件下微孔滤膜对色素吸附作用不明显。

2.5 不同处理方式的影响

考察了直接进样和聚酰胺处理进样两种方式对饮料中柠檬黄检测结果的影响。相对于聚酰胺处理方式，直接进样得到的检测结果及加标回收率比较高，说明聚酰胺对柠檬黄有吸附作用。因此，测定澄清的果汁饮料样品中的柠檬黄含量选择直接进样方式。

3 结论

采用聚酰胺吸附法提取饮料中的柠檬黄色素，前处理繁琐，还存在吸附不完全或者洗脱不完全的情况，造成色素损失，使得回收率偏低。样品pH值影响吸附过程，pH≥6会造成吸附不完全，而聚酰胺质量较大时，使得洗脱不完全。采用最优的聚酰胺处理条件，柠檬黄的加标回收率只能达到92.8%。因此，对于组分简单、澄清的饮料样品采用428 nm波长下直接稀释进样，可以得到较准确的实验结果，加标回收率高达99.5%，样品的色谱峰干净，杂质干扰少。

[1]刘胜男,张国庆,王素方,等.高效液相色谱法同时测定果蔬汁饮料中20种禁限用食品添加剂[J].轻工学报 ,2016(4)：23-29．