解胶剂对脱落细胞粘取器DNA检验的影响

张 竹 赖富平



解胶剂对脱落细胞粘取器DNA检验的影响

张 竹 赖富平

龙岩市公安局刑侦支队

：探讨折叠粘膜对粘膜DNA检验、解胶剂对折叠状粘膜的DNA检验的影响。：使用常规Chelex100法，分别提取伸展状、折叠状粘膜、加入解胶剂的折叠状粘膜。：组间两两比较，伸展组与折叠组、H解胶剂组与折叠组、D解胶剂组之间有显著差异；而从组间的平均峰面积看，H解胶剂组>伸展组>折叠组。：过分折叠对粘取器粘膜的DNA检验不利，溶解效果较强的解胶剂能更充分地释放被粘附的脱落细胞，Chelex100法结合滤膜离心套管，能有效避免无机提取溶液消化粘胶乳化的影响。

法医物证学 脱落细胞粘取器 DNA检验

脱落细胞粘取器（EZ-Tape）是提取指纹印、手套印等微量接触类脱落细胞经常使用的工具，但在剥离粘膜入管时，由于管内空间狭小和粘膜自身粘性等原因，时常会粘连、缠绕、折叠成团，致使粘有脱落细胞的一面裹在内部而影响检验。解胶剂（除胶剂或胶带剥离剂）是一种合成的化学药剂，能够快速、便捷、有效地去除油脂、胶水等化学成分，可以溶解各种固化后的胶粘剂。本文探讨折叠对粘膜的DNA检验是否有影响，以及解胶剂是否有利于折叠状粘膜的DNA检验。

1 材料与方法

1.1 材料来源

脱落细胞粘取器：北京泰德富臣科贸有限公司，圆形，直径2cm。

检材制作：在粘取器粘面上均匀涂布一定稀释度的血液样本，阴干。

解胶剂：搜集三种市售解胶剂，瓶身标识分别为“安戈洛瞬间胶解胶剂AD-1”“汇瑞胶粘解胶剂”“北京芬格尔华英科技有限责任公司胶带剥离剂”，分别编为D、F、H。

主要试剂和仪器：5%Chelex-100溶液、滤膜离心套管（南京多丽洋公司）、Micocon-100柱（美国Millipore公司）、ID-Plus试剂盒、9700扩增仪、3500xL遗传分析仪[2]。

1.2 方法

1.2.1解胶剂的pH值

将解胶剂滴在pH试纸上，与标准色版比较，读取pH值。

1.2.2解胶剂自身的DNA检验

采用ID-Plus试剂盒扩增解胶剂，分别编为DK、FK、HK，28循环、10μL体系，包含4μL Mix、2μL Primer、2μL H2O、2μL解胶剂。

1.2.3加入解胶剂的阳性样本DNA检验

扩增“解胶剂+9947A”，分别编为D+、F+、H+，同时扩增9947A作为对照，28循环、10μL体系，包含4μL Mix、2μL Primer、2μL解胶剂（对照组为2μL H2O）、2μL 9947A。

1.2.4折叠粘膜的DNA检验

取制作好的粘取器10个，分为伸展组（S）和折叠组（D），每组5个。伸展组：将粘附有血液的一面朝外，伸展状置于滤膜离心套管内；折叠组：将粘附有血液的一面朝内对折三次，置于消化套管内。在上述10管内均加入390μL 5%Chelex-100溶液、10μL PK，56℃消化3h，99℃煮沸10min，Micocon-100柱离心浓缩，ID-Plus试剂盒扩增，10μL体系（9+1），28循环[1]。

1.2.5加入解胶剂的折叠状粘膜的检验

取制作好的粘取器15个，平均分为三组（J1、J2、J3），将粘附有血液的一面朝内对折三次，置于滤膜离心套管内，三组分别加入D、F、H解胶剂400μL，37℃温育2h，离心去除解胶剂，并将粘膜展开，再加入390μL 5%Chelex-100溶液、10μL PK，后同1.2.4。

1.2.6 STR分型检测及数据分析

扩增产物经3500xL遗传分析仪检测，数据用GeneMapper ID-X软件分析，检测荧光强度RFU阈值设为100，计算样本的平均峰面积（=全部等位基因峰面积之和÷32），作为DNA定量比较的参考，用SPSS软件对数据进行统计学分析。

2 结果

三种解胶剂的pH值在5～3之间，属于酸性液体。直接扩增解胶剂，均未检出基因型（见图1），表明本次实验使用的三种解胶剂内没有外源性人类DNA污染。加入解胶剂的9947A均未获得STR分型，解胶剂对PCR扩增有明显抑制。

图1 三种解胶剂DNA检测结果

表2中，组别之间应用One-Way ANOVA 运算，两两之间比较的统计学差异有部分显著（=0.05），部分不显著，显著差异表现在S组与D组之间、J3组与D组、J1组之间，而从组别间的平均峰面积看，J3组>S组>J2组>J1组>D组，详见表1。

表1 扩增产物的平均峰面积（rfu）

*J1组中一个样本管壁破损，导致无结果。

表2 不同组别的平均峰面积进行两两比较的P值

3 讨论

结果显示，S组的平均峰面积显著高于D组，表明过分折叠对粘取器粘膜的DNA检验不利，提示粘有脱落细胞的一面要与提取液充分接触，以便更好地提取到DNA模板。

实验中，H解胶剂的溶解效果较强，粘膜的胶层全部溶解，展开完全，甚至部分底膜也被溶解，成团状粘附在管壁上不易脱落；而D解胶剂的溶解效果较弱，37℃温育2h，对折后的第一层仍不能展开；F解胶剂的溶解效果适中，胶层基本溶解，容易展开，同时底膜未溶解。J3组的平均峰面积显著高于D组、J1组，表明粘膜的胶层全部溶解能更充分地释放被粘附的脱落细胞，提高DNA回收率。实际应用时，可适当减少解胶剂的温育时间，在胶层全部溶解后、底膜未被溶解前，去除解胶剂，最大化地收集利用脱落细胞DNA。

滤膜离心套管的过滤器设计，使提取过程不用换管，能有效去除样本载体和Chelex树脂，避免无机提取溶液消化粘膜上粘胶而乳化、发白的影响[2],使获取的DNA更纯净，最大程度富集DNA提取液，增加下一步使用Micocon-100柱离心浓缩的原液体积。

解胶剂中含有丙酮、苯等有毒溶剂，应避免吸入，不同品牌的组成成分不同，其理化性质有待更深入的研究。

[1] 郑秀芬.法医DNA分析[M].北京:中国人民公安大学出版社,2002.

[2] 王德明,顾丽华,阎建军,等.3种提取胶带粘面汗潜指印中DNA的方法比较[J].中国法医学杂志,2005,20(2):65-67.