养殖水体中氨氮对大菱鲆的急性毒性效应研究

2017-02-09 09:25李之乡王伟继胡玉龙吴欢欢
海洋科学 2017年10期
关键词:大菱鲆白化存活

李之乡, 王伟继, 胡玉龙, 吕 丁, 吴欢欢, 栾 生, 孔 杰



养殖水体中氨氮对大菱鲆的急性毒性效应研究

李之乡1, 2, 3, 王伟继2, 3, 胡玉龙2, 3, 吕 丁2, 3, 吴欢欢1, 2, 3, 栾 生2, 3, 孔 杰1, 2, 3

(1. 上海海洋大学 水产与生命学院, 上海 201306; 2. 中国水产科学研究院 黄海水产研究所 农业部海洋渔业可持续发展重点实验室, 山东 青岛 266071; 3. 青岛海洋科学与技术国家实验室 海洋渔业科学与食物产出过程功能实验室, 山东 青岛 266071)

为了评估大菱鲆()耐氨氮性状的遗传参数和为循环水养殖大菱鲆提供科学指导, 作者研究了养殖海水中氨氮对4月龄和8月龄大菱鲆的急性毒性效应, 同时对比了氨氮对白化和正常个体、雌性和雄性个体的急性毒性效应差别。结果表明: 非离子氨对4月龄大菱鲆的24、48、72、96 h LC50分别为2.19、1.94、1.80、1.72 mg/L, 对8月龄大菱鲆的24、48、72、96 h LC50分别为3.64、3.02、2.93、2.86 mg/L, 非离子氨对4月龄和8月龄大菱鲆的安全质量浓度分别为0.17和0.29 mg/L; 氨氮对白化和正常大菱鲆以及雌性和雄性大菱鲆的急性毒性效应均没有显著性差异, 研究结果为进一步选育大菱鲆的耐氨氮品系提供科学依据。

大菱鲆(); 苗种; 氨氮; 急性毒性; 半致死浓度; 白化

大菱鲆()原产于欧洲, 自然分布于北起冰岛、南至摩洛哥附近的海域, 属于菱鲆科(Scophthalmidae)、菱鲆属()[1], 具有生长快、肉质细嫩、营养丰富、经济价值高和市场优势明显等优点[2]。1992年从英国引入中国, 并于1999年成功培育出第一批大菱鲆幼苗, 逐渐形成了“温室大棚+深井海水”的流水式工厂化养殖模式。然而该养殖模式因大面积抽取地下水资源, 使地下水水位大幅度下降, 已造成严重浪费[3-5]。

封闭式循环水养殖模式与“温室大棚+深井海水”的养殖模式相比, 具有节水、环保和高产等优势, 因此, 发展封闭式循环水养殖是实现渔业可持续发展的必然要求[6-7]。然而中国目前的循环水水处理工艺尚不成熟[8], 在循环水养殖系统中, 由于鱼的排泄物、残饵等有机物的长期积累, 极易导致水体中的氨氮含量过高。氨氮是水产养殖中制约鱼类生长的主要环境因子之一, 高浓度的氨氮能够抑制鱼类生长和存活, 对鱼的生理指标和组织器官起到负面作用, 同时能够诱发多种疾病, 对鱼体造成伤害[9]。因而研究在循环水养殖条件下氨氮对大菱鲆的毒性效应, 选育大菱鲆耐氨氮品系非常重要。

在实际生产中, 大菱鲆一般3~4月龄进行苗种培育, 14~18月龄达到上市规格[10]。此外, 大菱鲆在9~33月龄雌性个体体质量普遍大于雄性个体, 并且随着养殖时间的延长, 这种差异逐渐增大[11]。因此, 为保证实验所用的雌雄大菱鲆个体规格一致, 并在解剖时能够准确辨认性别, 本研究选择4月龄(苗种期)和8月龄(养殖中期)大菱鲆为实验材料。采用半致死浓度(Median lethal concentration, LC50)作为衡量水体中氨氮对大菱鲆急性毒性作用大小的参数[12], 并以存活时间为依据, 比较白化和正常以及雌性和雄性大菱鲆的耐氨氮能力, 最后对大菱鲆的体长、体质量、日龄以及氨氮耐受能力的相关性进行分析。以期为大菱鲆的循环水养殖技术提供参考, 为下一步评估大菱鲆耐氨氮性状遗传参数, 选育大菱鲆耐氨氮品系提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 实验材料

实验在山东海阳黄海水产有限公司大菱鲆育苗车间进行。实验鱼采用了180尾体质量为(115.92± 20.39)g的8月龄大菱鲆和360尾体质量为(6.53±1.14)g的4月龄大菱鲆。实验在半径为0.5 m、高0.7 m的圆形玻璃钢(Fiber Reinforced Plastics, FRP)容器中进行, 每个容器中加入240 L砂滤海水。实验所需氨氮浓度使用NH4Cl分析纯(天津北辰方正试剂厂)配制, 总氨氮浓度依据NH4Cl中N的含量计算求得。实验时称取所需要NH4Cl的量, 在海水中充分溶解后搅拌均匀。

1.2 实验方法

正式实验前先进行预实验, 摸索氨氮对大菱鲆致死的大致浓度范围。

实验开始之前停食3 d, 排空大菱鲆体内粪便, 最大限度地减少大菱鲆代谢对实验结果所造成的影响。根据预实验结果分别对4月龄大菱鲆和8月龄大菱鲆按等对数间距设置5个浓度组并设置对照(表1),每个浓度设3个重复。4月龄大菱鲆每个重复20尾, 其中10尾白化鱼, 10尾正常鱼。8月龄大菱鲆每个重复10尾, 其中2~3尾白化鱼, 其余为正常鱼。而4月龄大菱鲆解剖时辨认性别比较困难, 故只解剖了8月龄大菱鲆, 记录雌雄数据。

表1 氨氮对大菱鲆急性毒性实验浓度设置

注: 表中NH3-Nm表示非离子氨浓度, NH3-Nt表示总氨氮质量浓度, 单位: mg/L

实验采用半静水式生物测试法[13], 实验水温维持在22.5℃±1℃, pH8.0~8.1, 盐度30, 溶解氧维持在5.5~7.0 mg/L。实验过程中每24 h更换1次相应NH4Cl浓度的海水, 每天的换水量为100%, 实验期间不投饵。实验开始第1天每1 h观察1次, 后期每2 h观察1次鱼的死亡情况, 及时将死亡鱼捞出, 解剖辨别雌雄并记录死亡时间、体长、体质量以及是否白化等数据。

最后根据4月龄大菱鲆的急性毒性实验所计算出的72 h半致死浓度对954尾4月龄大菱鲆幼鱼进行氨氮胁迫实验。实验在半径为1.2 m、高0.6 m的玻璃钢容器中进行, 并维持与上述相同的实验条件, 直至所有个体全部死亡。

1.3 数据的统计分析

1.3.1 半致死浓度的计算

半致死浓度的计算采用改进寇氏法[12]:

LD50的95%可信限=lg–1(lgLD50±1.96×x50) (3)

安全浓度(S)计算公式:S=96h LC50×0.1

1.3.2 非离子氨浓度的计算

总氨氮与非离子氨的浓度按如下公式换算[14]:

pa·T=9.245+0.002 949+0.032 4(298–) (6)

1.3.3 数据分析

将在相同实验条件下大菱鲆的存活时间作为耐氨氮能力的指标。分别将D、E、F组中的3个重复数据合并到一起, 白化用0表示, 正常用1表示。雌性用0表示, 雄性用1表示。使用SPSS19.0中的Kaplan-Meier生存分析模型分别对合并后的D、E、F组数据进行分析, 分别比较白化和正常以及雌性和雄性大菱鲆在相同氨氮条件下的中位生存时间是否具有差异性(<0.01, 差异极显著,<0.05, 差异显著)。

使用SPSS19.0对测得的4月龄大菱鲆体长、体质量、日龄和存活时间进行Pearson相关性分析。

2 实验结果与分析

2.1 氨氮对4月龄和8月龄大菱鲆的急性毒性作用

由氨氮对大菱鲆的急性毒性实验结果可知(表2), 在相同的时间内, 氨氮浓度越高, 大菱鲆死亡数量越多; 在相同的NH4Cl浓度下, 随着氨氮胁迫时间的延长, 大菱鲆死亡数量逐渐增多。各重复组之间的死亡情况基本一致, 采用各组的平均死亡率来计算半致死浓度。

通过计算得到4月龄大菱鲆和8月龄大菱鲆的半致死浓度如表3所示。随着氨氮浓度的增加, 其毒性逐渐增强。非离子氨对4月龄大菱鲆的24、48、72、96 h LC50分别为2.19、1.94、1.80、1.72 mg/L。非离子氨对8月龄大菱鲆的24、48、72、96 h LC50分别为3.64、3.02、2.93、2.86 mg/L。非离子氨对4月龄和8月龄大菱鲆的安全浓度分别为0.17和0.29 mg/L, 8月龄大菱鲆非离子氨的安全浓度是4月龄大菱鲆的1.71倍。

表2 氨氮对4月龄和8月龄大菱鲆的急性毒性实验结果

表3 氨氮对大菱鲆的半致死浓度(95%可信限)和安全浓度(mg/L)

注: 表中NH3-Nm为非离子氨; NH3-Nt为总氨氮

2.2 氨氮对正常和白化大菱鲆急性毒性作用的比较

分别选取死亡数量较多的D、E、F组4月龄和8月龄大菱鲆的死亡数据, 比较白化鱼和正常鱼对氨氮的耐受能力。

图1和图2分别列出了所用实验组4月龄、8月龄白化和正常大菱鲆存活时间的中位数、第一四分位数、第三四分位数、最小值、最大值和异常值。由图1、图2可见, 随着氨氮浓度的升高, 其存活时间越短。其中在第D实验组中白化与正常大菱鲆的存活时间箱线图形态稍有不同, E、F组中基本一致。表4分别列出了4月龄、8月龄大菱鲆各分析组中白化和正常鱼的数量以及平均体质量。统计分析表明, 在相同的氨氮浓度条件下, 4月龄、8月龄的白化与正常大菱鲆, 其存活时间均没有显著性差异, 即白化大菱鲆和正常大菱鲆对氨氮的耐受能力没有显著性差异。

图1 四月龄白化和正常大菱鲆存活时间的箱线图

图2 八月龄白化和正常大菱鲆存活时间的箱线图

2.3 氨氮对雌雄大菱鲆急性毒性作用的比较

选取8月龄大菱鲆的D、E、F组数据, 比较雌性和雄性大菱鲆对氨氮耐受能力的差异性。

从图3可见, 在第D、F组实验中雄性大菱鲆耐氨氮存活时间的下四分位数要明显比雌性大菱鲆的低, 而E两组中的盒形图基本一致。表5分别列出了8月龄大菱鲆各分析组中雌性和雄性鱼的数量以及平均体质量, 统计分析结果表明, 8月龄雌性和雄性大菱鲆之间对氨氮的耐受能力并没有显著性差异。

2.4 体质量、体长、日龄与大菱鲆耐氨氮的相关性比较

图4给出了954尾大菱鲆在39.06 mg/L的氨氮质量浓度下其存活时间与体质量的关系。从图4中可以看出, 大菱鲆的存活时间在60~128 h之间比较集中, 体质量与存活时间没有相关性。对大菱鲆的体质量、体长、日龄和存活时间进行相关性分析, 其结果如表6所示。由分析结果可知, 大菱鲆的体质量和体长、体质量和日龄、体长和日龄均呈极显著正相关。而大菱鲆在氨氮胁迫下的存活时间和体质量、存活时间和体长、存活时间和日龄均表现为不相关(||<0.3)[15]。

表4 不同浓度条件下4月龄、8月龄大菱鲆白化和正常个体的数量及平均体质量

图3 八月龄雌性和雄性大菱鲆存活时间的箱线图

表5 不同浓度条件下8月龄大菱鲆雌性和雄性个体的数量及平均体质量

图4 大菱鲆耐氨氮存活时间与体质量的关系

3 讨论

3.1 氨氮的急性毒性效应评价

表6 大菱鲆急性毒性实验存活时间、体重、体长和日龄的相关性分析

**. 相关性在0.01的水平上有显著性(双尾)

不同的水生生物对非离子氨的耐受能力有较大的差异, 而同种水生生物的不同发育阶段对非离子氨的耐受能力同样差别比较明显。已有研究表明, 罗氏沼虾()[19]、黄颡鱼()[20]、鲤鱼()[21]、史氏鲟()[22]、斜带石斑鱼()[23]等水产动物对非离子氨的耐受能力均有所差别, 并且其规格越大, 对氨氮的耐受能力越强。在本实验中得出8月龄大菱鲆的24、48、72、96 h等各时间段的半致死浓度均比4月龄大菱鲆的要高, 说明8月龄大菱鲆比4月龄大菱鲆对氨氮的耐受能力更强。这与上述水产动物其规格越大, 耐氨氮能力越强的研究结果相一致。而在本实验中对954尾大菱鲆的急性毒性实验结果得出, 大菱鲆的耐氨氮性状与大菱鲆的体长、体质量等生长性状没有相关性。可能是因为采用的954尾4月龄大菱鲆规格差异相对较小, 对氨氮的耐受能力没有表现出显著性差异。

曲克明等[24]在水温16℃±1℃的条件下研究了非离子氨对大菱鲆(体长2.0~2.4 cm)的96 h LC50值为1.14 mg/L, 其结果与本实验在22.5℃±1℃条件下得出的非离子氨对大菱鲆(体长4~7 cm)的96 h LC50值(1.94 mg/L)有所差别。可能主要的原因是鱼的规格和实验水体温度不一样导致的。因为氨氮的毒性与养殖水体的pH、温度以及溶解氧等密切相关。离子氨转化为非离子氨是一个吸热的过程, 养殖水体温度越高, 非离子氨所占的比例越大, 氨氮对水产动物的毒性越强[25]。

3.2 非离子氨的安全浓度评价

非离子氨对鱼类的影响有急性毒性效应和慢性毒性效应。而在实际生产中比较常见的是慢性毒性效应。在大菱鲆的长期养殖过程中, 海水中氨氮浓度过高, 会显著降低大菱鲆的生长速度、成活率以及饲料利用率等[26]。Foss等[27]和Ruyet等[26]分别报道了当非离子氨质量浓度超过0.17和0.21 mg/L时, 会对大菱鲆幼鱼的生长产生负面影响。这与作者研究的非离子氨对4月龄大菱鲆的安全质量浓度(0.17 mg/L)基本一致。因此, 在大菱鲆的长期养殖过程中应该对非离子氨的浓度进行实时监测, 当非离子氨的质量浓度超过0.17 mg/L时应该采取紧急措施, 降低水体中的氨氮含量, 避免水体环境对鱼体造成伤害。

3.3 白化和正常以及雌性和雄性大菱鲆对氨氮的耐受性比较

白化病是大菱鲆海水养殖中的一种常见疾病, 有关大菱鲆白化病的机制目前尚不清楚[28]。白化鱼被消费者认为是劣质产品, 其市场价值远低于正常鱼[29]。然而在实际养殖中, 部分从业人员根据直观观察, 认为白化大菱鲆在生长速度和抗病方面均要优于同批次的正常大菱鲆[30]。已有研究表明, 白化和正常大菱鲆个体在生长速度和总体营养成分方面并没有显著性差异[30-31]。而关于白化和正常大菱鲆的抗性比较, 目前还没有研究。在本实验中对正常和白化大菱鲆以及雌性和雄性大菱鲆的耐氨氮能力进行了比较, 结果表明两者之间均没有差异显著性。

本研究首次对白化和正常大菱鲆个体以及雌性和雄性大菱鲆个体的耐氨氮性状进行了比较, 并且计算了在22.5℃±1℃条件下氨氮对不同发育阶段大菱鲆个体的半致死浓度和安全质量浓度。研究结果为循环水养殖大菱鲆提供科学指导, 并且对大菱鲆耐氨氮品种的选育具有重要参考价值。

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(本文编辑: 谭雪静)

Acute toxicity of ammonia nitrogen on turbot ()

LI Zhi-xiang1, 2, 3, WANG Wei-ji2, 3, HU Yu-long2, 3, LÜ Ding2, 3, WU Huan-huan1, 2, 3, LUAN Sheng2, 3, KONG Jie1, 2, 3

(1. College of Fisheries and Life Science, Shanghai Ocean University, Shanghai 201306, China; 2. Key Laboratory of Sustainable Development of Marine Fisheries, Ministry of Agriculture, Yellow Sea Fisheries Research Institute, Chinese Academy of Fishery Sciences, Shandong, Qingdao 266071, China; 3. Laboratory for Marine Fisheries Science and Food Production Processes, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Shandong, Qingdao 266071, China)

In this paper, we investigated the acute toxic effects of ammonia nitrogen on 4-month-old and 8-month- old turbot (), and compared the acute toxicity effects of ammonia nitrogen on albino and normal female and male turbot. The results showed that the median lethal concentrations (LC50) at 24, 48, 72, and 96 h for un-ionized ammonia on 4-month-old turbot were 2.19, 1.94, 1.80, and 1.72 mg/L, respectively. The LC50values at 24, 48, 72, and 96 h for un-ionized ammonia on 8-month-old turbot were 3.64, 3.02, 2.93, and 2.86 mg/L, respectively. The safe concentrations of non-ionic ammonia on 4-month-old and 8-month-old turbot were 0.17 mg/L and 0.29 mg/L, respectively. Although the 8-month-old turbot was more tolerant to ammonia nitrogen than the 4-month- old turbot, there was no significant difference in either the correlation between body weight and ammonia resistance or body length and ammonia resistance. A comparison of the ammonia nitrogen acute toxicity in albino and normal female and male turbot revealed no significant differences. The results obtained in this study provide scientific guidance for the circulation water farming of turbot and a theoretical basis for evaluating the genetic parameters of ammonia-resistant traits and further selection breeding of ammonia-nitrogen-resistant strains of turbot.

; fry; ammonia; acute toxicity; LC50; albino

Apr. 10, 2017

S931.3

A

1000-3096(2017)10-0109-08

10.11759//hykx2017041003

2017-04-10;

2017-04-28

[Taishan Scholar Program for Seed Industry, No. ZR2014CQ001; Key Research and Development Project of Shandong Province, No.2016ZDJS06A07; The National High Technology Research and Development Program of China, No.2012AA10A408-7]

泰山学者种业计划专家项目(ZR2014CQ001); 山东省重点研发计划项目(2016ZDJS06A07); 国家高技术研究发展计划(863)(2012AA10A408-7)

李之乡(1991-), 男, 山东临沂人, 硕士研究生, 主要从事水产动物遗传育种工作, E-mail: lizhixiang26@163.com; 王伟继, 通信作者, E-mail: wangwj@ysfri.ac.cn

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