绿茶多酚对急性酒精性肝损伤小鼠抗氧化能力及细胞色素 C水平的影响

程学敏 黎海娟 黄 茜 黎丽芳 覃 卿 赵 爽 黄彦峰

(右江民族医学院临床医学院，广西 百色 533000)

绿茶多酚对急性酒精性肝损伤小鼠抗氧化能力及细胞色素 C水平的影响

程学敏 黎海娟 黄 茜 黎丽芳 覃 卿 赵 爽1黄彦峰1

(右江民族医学院临床医学院，广西 百色 533000)

目的 观察绿茶多酚对急性酒精性肝损害小鼠肝脏抗氧化能力及反映线粒体功能的细胞色素(Cyt)C释放调控的影响。方法 40只小鼠随机分为空白对照组、模型组、绿茶多酚低、中、高剂量组(100，150，200 mg·kg-1·d-1)，每组8只，绿茶多酚各剂量组灌胃给予受试液，连续15 d，第16天起绿茶多酚各剂量组和模型组灌胃给予白酒12 ml/kg，连续3 d，造成急性肝损伤，酶标光度分析检测血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、丙二醛(MDA)、总抗氧化能力(T-AOC)，ELISA法检测肝细胞胞质及线粒体Cyt C的表达水平。 结果 小鼠急性酒精性肝损伤模型复制成功，与模型组相比，绿茶多酚高剂量组肝脏指数、ALT、AST、MDA、胞质及线粒体Cyt C水平降低(P<0.05)，T-AOC水平明显升高(P<0.05)。 结论 绿茶多酚对酒精性肝损伤小鼠肝细胞具有一定保护作用，其机制可能与其抗氧化应激，阻抑Cyt C释放有关。

酒精性肝损伤; 绿茶多酚; 细胞色素C

大量饮酒可引起器官损害特别是肝脏急性损伤〔1〕。乙醇诱导急性肝损伤的机制尚未完全阐明，目前研究显示，急性酒精性肝损伤的发病可能与乙醇摄入后其代谢产物引起的肝脏氧化应激及肝细胞凋亡过度等机制有关〔2～4〕，尚且仍无特异理想的防治药物干预措施，现今一些中药等天然抗氧化植物成分成为药物研究热点〔5,6〕。 广西依托地域地质优势，盛产优质绿茶，其中茶多酚、咖啡碱、脂多糖、茶氨酸等可保留鲜叶的85%以上，而绿茶多酚就是绿茶中重要的天然药效成分之一，以往研究显示，其具有调节血脂、预防心血管疾病、抗氧化等多种药理作用〔7〕，但其对酒精性肝损伤的预防和保护机制研究甚少，本研究利用小鼠急性酒精性肝损害动物模型，观察绿茶多酚对肝脏抗氧化能力及反映线粒体功能的细胞色素(Cyt)C释放调控的影响，探讨其对急性酒精性肝损伤肝脏的保护作用机制。

1 资料与方法

1.1 药品、试剂 市售北京红星二锅头白酒(53°)；绿茶提取物(纯度≥98%，由西安市洋东新城汇林生物制品公司提供)；丙氨酸氨基转移酶(ALT)测试试剂盒(批号20141010)，天冬氨酸氨基转移酶(AST)测试试剂盒(批号20141010)，丙二醛(MDA)检测测试盒(批号20141125)，总抗氧化能力(T-AOC)检测试剂盒(批号20141125)，考马斯亮蓝法蛋白定量测试试剂盒，小鼠CytC ELISA检测试剂盒(批号20150401)，以上均购自南京建成生物研究所。

1.2 主要仪器 漩涡混匀机(上海医科大学仪器厂)、722型可见光分光光度仪(上海精密科学仪器有限公司)、标准规格酶标分析仪、离心机(上海安亭科学仪器厂)、超声粉碎机(宁波东南仪器有限公司)、水浴恒温箱等。

1.3 动物 雄性昆明种小鼠40只，体重约(20±2)g，右江民族医学院实验动物中心供给，动物合格证号SCXK(桂)2012-0003。对实验动物的处理符合医学伦理学标准。

1.4 观察指标与方法

1.4.1 动物分组及模型制备 雄性昆明种小鼠40只，体重约(20±2)g，随机分为五组：空白对照组、模型组、绿茶多酚低、中、高剂量组，分别给予绿茶多酚100，150，200 mg·kg-1·d-1，每组8只。绿茶多酚各剂量组灌胃(ig)给予受试液，空白对照组和模型组ig给予同等体积生理盐水，每日1次，连续15 d。第16天起，绿茶多酚各剂量组和模型组ig给予北京红星二锅头白酒(53°)12 ml/kg，每天1次，连续3 d，造成急性肝损伤模型，空白对照组ig给予同等体积生理盐水。

1.4.2 指标测定 末次ig 16 h后摘除眼球取血，血液静置2 h，4 ℃，3 500 r/min离心10 min，取血清留存待测，应用紫外分光光度计检测血清ALT、AST等生化指标，检测步骤严格按照试剂盒使用说明书进行。

小鼠断椎处死后称取尸重，迅速剖腹取出肝脏，用生理盐水冲除表面血液，准确称取肝脏重量，计算肝指数，肝指数=〔肝脏重量(g)/动物体重(g)〕×100%。然后按肝脏重量体积比加9倍预冷生理盐水制成10%的肝脏组织匀浆，分别做两种不同处理：10%的肝脏组织匀浆1 500 r/min离心10 min，取肝上清液样本，待测MDA和T-AOC，检测步骤严格按照按MDA和T-AOC试剂盒使用说明书操作。另取10%的肝脏组织匀浆600 r/min离心15 min，取上清液12 000 r/min再次离心，4 ℃，15 min，上清液为胞质，留样待胞质Cyt C测定。沉淀为线粒体，加入0.1 mol/L Tris-HCl 0.5 ml制备线粒体悬液，使用超声粉碎机使线粒体破碎，留样待线粒体Cyt C测定。Cyt C测定严格按照ELISA检测试剂盒使用说明书步骤进行。

1.5 统计学方法 采用SPSS13.0软件包进行方差分析及t检验。

2 结 果

2.1 绿茶多酚对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏指数及血清ALT、AST的影响 模型组及用药各组小鼠均表现为反应淡漠，行走不稳，活动减少。与空白对照组比较，模型组肝脏指数及血清中ALT、AST均明显增高(P<0.01)，表明急性酒精性肝损伤小鼠肝脏组织受到损伤，且有肝脏肿胀现象，造模成功。与模型组比较，绿茶多酚各剂量组肝脏指数下降(P<0.05)，血清ALT、AST含量均下降(P<0.05)，表明绿茶多酚对肝细胞具有一定保护作用。见表1。

2.2 绿茶多酚对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏组织MDA及T-AOC的影响 与空白对照组比较，模型组肝组织MDA含量升高(P<0.01)，T-AOC水平降低(P<0.01)，说明抗氧化能力降低。与模型组相比，绿茶多酚高剂量组MDA含量降低(P<0.05)，而绿茶多酚低、中剂量组MDA含量无明显改变(P>0.05)；绿茶多酚各剂量组T-AOC水平均升高(P<0.01)，提示绿茶多酚一定程度上能够提高肝组织的抗氧化能力，改善肝功能。见表1。

2.3 绿茶多酚对急性酒精性肝损伤小鼠肝脏细胞胞质及线粒体Cyt C水平的影响 与空白对照组相比，模型组肝细胞胞质及线粒体Cyt C水平升高(P<0.05，P<0.01)，提示Cyt C大量释放，线粒体功能受到影响。与模型组相比，绿茶多酚中剂量组胞质Cyt C水平降低(P<0.05)，绿茶多酚低、中、高剂量组线粒体Cyt C水平降低(P<0.05,P<0.01)，提示Cyt C释放量减少，线粒体功能部分恢复。见表1。

组别肝脏指数(%)AST含量(U/L)ALT含量(U/L)MDA含量(nmol/mgprot)T-AOC含量(U/mgprot)CytC(ng/ml)胞质线粒体空白对照组4.12±0.18161.35±45.5656.67±5.053.29±0.611.20±0.3015.95±0.942.19±0.87模型组5.10±0.672)285.96±49.032)106.82±7.462)5.25±0.952)0.54±0.022)18.65±1.761)5.39±0.982)绿茶多酚低剂量组4.05±0.254)174.52±5.874)62.60±4.024)4.33±0.991.21±0.184)16.94±0.312.97±1.563)绿茶多酚中剂量组4.41±0.233)200.26±33.964)113.31±10.184.46±1.301.23±0.194)16.31±0.983)2.34±0.794)绿茶多酚高剂量组4.24±0.234)96.19±10.324)69.21±7.984)4.05±1.123)1.31±0.354)16.85±1.752.09±0.824)

与空白对照组比较：1)P<0.05，2)P<0.01；与模型组比较：3)P<0.05，4)P<0.01

3 讨 论

目前认为，氧化应激是急性酒精性肝损伤重要的发病机制之一。酒成分乙醇在肝脏内经过复杂的代谢过程生成乙醛，与此同时也会产生大量的氧自由基，发生脂质过氧化，导致肝细胞受损。机体因具备抗氧化防御系统而原本具有抗氧化能力，但氧自由基的大量产生可以使机体的抗氧化能力降低，为了反映机体的抗氧化能力与状态及氧自由基的活性，可以采用T-AOC这一指标来进行衡定和评价；不饱和脂肪酸的代谢，因存在大量活性氧和氧自由基的参与，导致产物含有可引起细胞功能障碍甚至诱发肝细胞凋亡的MDA聚集，因此，MDA含量变化可以反映氧化应激对肝脏的损害强度〔8〕。Cyt C是线粒体氧化呼吸链唯一的水溶性球状蛋白，与线粒体内膜的心磷脂结合，位于线粒体内外膜之间的膜间隙，Cyt B和细胞色素氧化酶之间。Cyt C正常时不能通过线粒体外膜，但当组织发生氧化应激，自由基产生增多，线粒体外膜就会形成孔道即渗透性转换孔隙(PTP)复合物，由应激下线粒体外膜蛋白聚集而成，调控重要的促凋亡因子Cyt C的释放，导致细胞受损甚至发生细胞凋亡，即Cyt C的释放量改变与生物膜的结构和功能状态密切相关〔9,10〕。

本实验结果显示，当大量乙醇在体内氧化代谢时，肝组织细胞发生氧化应激及脂质过氧化损伤，会消耗大量的抗氧化物质，肝脏抗氧化能力减弱，难以清除过多的自由基，导致T-AOC降低；线粒体内膜、外膜通透性均有增大，引起Cyt C自线粒体膜间大量释放，足以启动细胞凋亡线粒体通路级联反应程序，导致细胞凋亡过度，同时血清转氨酶释放性升高，与肝细胞发生氧化应激及脂质过氧化损伤甚至导致肝细胞膜和细胞器膜的损害关系密切。本实验提示绿茶多酚对急性酒精中毒的肝脏具有一定的保护作用。绿茶多酚药理活性多样，因其化学结构中包含多酚羟基，易被氧化而提供出H+质子，尤其具有强大的抗氧化能力(是Vit C的100倍，Vit E的20倍)〔11,12〕，在本实验中保护肝细胞代谢与功能的可能机制是其能够有效清除自由基，抑制脂质过氧化，减少肝细胞膜及细胞器膜氧化应激损伤，从而发挥稳定细胞，抑制Cyt C的释放，促进能量代谢，抑制炎症反应，阻断细胞凋亡通路的共同途径等功能以保护肝脏。

本实验结果初步证实，绿茶多酚对急性酒精性肝损伤小鼠防治干预有效，具有进一步研究的价值，但研究结果中绿茶多酚不同剂量对各效应指标的影响尚未完全呈现一致性剂量效应关系，因而绿茶多酚对急性酒精性肝损伤防治干预的有效剂量和作用机制仍需进一步探讨。

1 Gao B,Bataller R.Alcoholic liver disease:pathogenesis and new therapeutic targets〔J〕. Gastroenterology,2011;141(5):1572-85.

2 Beier JI,Arteel GE,McClain CJ.Advances in alcoholic liver disease〔J〕. Curr Gastroenterol Rep,2011;13(1):56-64.

3 Darwish HA,Abd Raboh NR,Mahdy A.Camel′s milk alleviates alcohol-induced liver injury in rats〔J〕. Food Chem Toxicol,2012;50(5):1377-83.

4 魏 芳,许瑞杰,蔡诗怡,等.石榴多酚对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用〔J〕. 中国中药杂志,2014;39(14):2721-5.

5 赖志红,袁云芬.当归芍药散对酒精性肝硬化伴门脉高压性腹水患者的血清ET-1及VEGF水平的影响〔J〕. 中国实验方剂学杂志,2015;21(1):195-8.

6 张英莉,范 颖,訾 慧,等.保肝颗粒对小鼠急性酒精性肝损伤的保护作用〔J〕. 中国实验方剂学杂志,2015;21(12):108-11.

7 Siripatrawan U,Harte BR.Physical properties and antioxidant activity of an active film from chitosan incorporated with green tea extract〔J〕. Food Hydrocolloids,2010;24(8):770-5.

8 李素婷,张子俊,杜 超,等.山楂叶总黄酮对酒精性肝损伤小鼠脂质过氧化水平的影响〔J〕. 中国老年学杂志,2014;34(4):1012-4.

9 王春妍,杨向东,胡东胜.大承气汤对急性肝衰竭大鼠肝组织Smac、细胞色素C及Caspase-3表达的影响〔J〕. 中华中医药杂志,2015;30(4):1249-52.

10 李小倩,冯润荷,李 静,等.过氧化氢对游离线粒体Cyt-c释放的影响〔J〕. 天津医药,2014;42(3):220-3.

11 谷晓青,马海燕,蔡桂林.绿茶提取物抗氧化的研究及在冰淇淋中的应用〔J〕. 内蒙古科技与经济,2013;19(1):86-7.

12 王振富,钟 灵,杨付明.恩施硒茶多酚的抗衰老作用〔J〕. 中国老年学杂志,2014;34(6):1557-9.

〔2016-03-20修回〕

(编辑 曹梦园)

广西自然科学基金项目(2016GXNSFAA380278，2014GXNSFBA118172)；广西高校科学技术研究项目(KY2015YB229)；广西高校大学生创新创业训练计划项目(201410599009)；广西高校重点实验室开放课题(gxzdsysyy2015207)

赵 爽(1980-)，女，硕士，副教授，硕士生导师，主要从事内分泌病理生理学研究。 黄彦峰(1977-)，女，实验师，主要从事生理学实验技术及中草药药效学研究。

程学敏(1994-)，女，主要从事内分泌病理生理学研究。

R285.5

A

1005-9202(2017)01-0040-03；

10.3969/j.issn.1005-9202.2017.01.017

1 右江民族医学院基础医学院 广西高校桂西地区高发病防治研究重点实验室