大头菜发酵菌株比例及发酵工艺优化

唐玲，曾许珍，张静，张碧莹，蒋和体*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715) 2(重庆市威利农业开发有限公司，重庆，404700)

大头菜发酵菌株比例及发酵工艺优化

唐玲1，曾许珍2，张静1，张碧莹1，蒋和体1*

1(西南大学 食品科学学院，重庆，400715) 2(重庆市威利农业开发有限公司，重庆，404700)

选择合适的发酵条件对大头菜发酵过程中的产酸和感官评价至关重要，首先进行菌株的组合优化，通过优势菌群的构建和发酵菌株的配比优化实验确定适合大头菜发酵的菌种比例为鼠李糖乳杆菌∶肠膜明串珠菌∶短乳杆菌=3∶2∶3；然后以大头菜为原料进行乳酸菌接种发酵，通过单因素实验和正交试验最终确定大头菜的最佳发酵工艺条件为乳酸菌(鼠李糖乳杆菌∶肠膜明串珠菌∶短乳杆菌=3∶2∶3)接种量2%， 食盐浓度8%，发酵温度27 ℃，发酵时间90 d。

大头菜；乳酸菌；发酵；菌种比例；工艺优化

大头菜(Brassicajuncesvar.megarrhizaTsen et Lee)又名根用芥菜、辣疙瘩、诸葛菜[1]，属于十字花科芸薹属，为1年或2年生草本植物，是一种以其膨大的肉质根为产品器官的根用蔬菜。大头菜富含蛋白质、矿物质、氨基酸、维生素A、维生素C、胡萝卜素、钙、铁、磷等营养物质[2-3]，含有丰富的膳食纤维，可促进结肠蠕动，防止便秘。

目前，传统发酵大头菜以自然发酵为主，该方法发酵时间较长，不利于品质控制，在发酵过程中易面临营养成分流失及亚硝酸盐、大肠杆菌超标等不容忽视的问题，影响企业的经济效益，不利于工厂化、规模化和标准化。因此，如何保持产品品质、提高安全性、缩短生产周期就成为研究的热点[4-5]。接种发酵已较多运用到榨菜、泡菜等发酵中[6-8]，具有提升产品品质、提高安全性和缩短发酵时间的作用，但将菌种接种到大头菜中进行半固态发酵的研究甚少。因此，本文以重庆市巫山县大头菜原料生产基地的大头菜为材料，旨在研究乳酸菌(鼠李糖乳杆菌、肠膜明串珠菌和短乳杆菌)的主要发酵特性，探索最佳的乳酸菌菌种比例，进行人工接种发酵大头菜试验，优化发酵工艺，为乳酸菌发酵剂在大头菜生产中的进一步研究和推广应用提供理论和实践依据。

1 材料与方法

1.1 材料与菌种

大头菜：重庆市巫山大头菜基地提供；食盐(食用级)：购于重庆市北碚区永辉超市；鼠李糖乳杆菌(6001)、肠膜明串珠菌(6055)、短乳杆菌(6239)：中国工业微生物菌种保藏管理中心。

1.2 培养基与试剂

MRS培养基：葡萄糖20 g/L，牛肉膏10 g/L，酵母膏粉5 g/L，胰蛋白胨10 g/L，醋酸钠5 g/L，吐温80 0.1 g/L，柠檬酸二铵2 g/L，MnSO40.28 g/L，MgSO40.58 g/L，pH 6.2～6.4，121 ℃灭菌15 min。

大头菜汁培养基：将无病虫害、体积适当的新鲜大头菜清洗干净后，切块，按照大头菜与蒸馏水1∶1的质量比混合于打浆机中打浆，过滤，再加入2%葡萄糖、1%蛋白胨，调pH 6.8；用于菌种特性检验和制备发酵剂。

AgNO3(分析纯)：重庆川东化工(集团)有限公司；络酸钾(分析纯)：重庆北碚化学试剂厂；NaOH(分析纯)：重庆川东化工(集团)有限公司；无水乙醇(分析纯)：成都市科龙化工试剂厂；酚酞(分析纯)：重庆川东化工(集团)有限公司。

1.3 仪器与设备

FA2004A电子天平，上海精天电子仪器厂；R2070飞利浦搅拌机，飞利浦电子香港有限公司；HWS-26数显恒温水浴锅，金坛市富华仪器有限公司；7200可见分光光度计，优尼柯(上海)仪器有限公司；DL-1电炉，中兴伟业仪器有限公司；滴定装置，上海精宏实验设备有限公司；PHS-3C型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；HH.BLL.600-S恒温培养箱，上海跃进医疗器械厂；不锈钢手提式灭菌器DSX-280A型，上海申安医疗器械厂；无菌操作台VD-650型，苏州净化设备有限公司；牛津杯(内径为6 mm，外径为8 mm，高10 mm),上海申源科学仪器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 菌种活化

将保藏于冰箱中的鼠李糖乳杆菌、肠膜明串珠菌、短乳杆菌3株乳酸菌的菌种分别接种于MRS培养基中，于30 ℃恒温培养箱中活化36 h。然后在超净工作台内，把已活化菌种接种至10 mL经灭菌后的大头菜汁培养基中于30 ℃下恒温培养24～36 h。

1.4.2 乳酸菌的活化与培养

乳酸菌菌种活化与培养[9]：将稀释后的乳酸菌液接种于MRS培养基，无氧条件37 ℃培养。将生长良好的单菌落进行划线分离并分别接种，再次分别进行无氧条件和有氧条件培养，并将生长良好菌种标记后保存。

1.4.3 优势菌群的构建

参照张超[10]方法，按鼠李糖乳杆菌：肠膜明串珠菌：短乳杆菌不同比例(3∶0∶0、0∶3∶0、0∶0∶3、1.5∶1.5∶0、1.5∶0∶1.5、0∶1.5∶1.5、1∶1∶1)接入3%乳酸菌于盐度为8%的大头菜中，在30 ℃下进行发酵，90 d后对以上7组试验(及自然发酵对照组)进行总酸含量测定，并进行感官评价，以确定菌株的优势菌群。

1.4.4 发酵菌株比例优化

参照王巧[11]方法，根据所得出的优势菌群结果确定目标菌为鼠李糖乳杆菌、肠膜明串珠菌、短乳杆菌，通过拮抗试验，确定3株目标菌之间没有拮抗作用，运用正交助手软件得到以下9组配比结果：1∶1∶1、1∶2∶2、1∶3∶3、2∶1∶3、2∶2∶1、2∶3∶2、3∶1∶2、3∶2∶3、3∶3∶1。根据配比按照质量比制作菌剂。按质量接种3%的菌种加入到盐度为8%的大头菜中，在30 ℃下进行发酵，90 d后对以上9组试验进行总酸含量测定，并进行感官评价，以确定最优的菌种组合。

1.4.5 大头菜发酵工艺流程

菌种→活化→一次扩大培养→二次扩 大培养

↓接种或不接种

原料→清洗→晾晒→切块→第一次加盐→脱水→第二次加盐→发酵→成品

1.4.6 大头菜发酵工艺优化

1.4.6.1 食盐浓度

按质量分别添加6%、7%、8%、9%、10%的食盐，在乳酸菌接种量为3%，27 ℃条件下发酵80 d，并对发酵大头菜进行总酸含量测定及感官评价，研究食盐浓度对大头菜发酵产酸和感官评价的影响。

1.4.6.2 乳酸菌接种量

按质量分别接种1.0%、2.0%、3.0%、4.0%、5.0%、6.0%的乳酸菌，在食盐浓度为8%，发酵温度为27 ℃的条件下发酵80 d，并对发酵大头菜进行总酸含量测定及感官评价，研究乳酸菌接种量对大头菜发酵产酸和感官评价的影响。

1.4.6.3 发酵温度

按照大头菜发酵工艺的流程，在盐浓度为8%，乳酸菌接种量为3%的条件下，分别在18、21、24、27、30 ℃的条件下发酵80 d，并对发酵大头菜进行总酸含量测定及感官评价，研究发酵温度对大头菜发酵产酸和感官评价的影响。

1.4.6.4 发酵时间

按照大头菜发酵工艺的流程，在盐浓度为8%，乳酸菌接种量为3%，发酵温度为27 ℃的条件下，分别发酵60、70、80、90、100 d，并对发酵大头菜进行总酸含量测定及感官评价，研究发酵时间对大头菜发酵产酸和感官评价的影响。

1.4.7 大头菜发酵工艺正交试验设计

选取食盐浓度(A)、乳酸菌接种量(B)、发酵温度(C)和发酵时间(D)单因素中较优的发酵条件设计正交试验因素水平表，在此基础上，以总酸和感官评分作为评定指标，采取L9(34)正交试验来确定最优的发酵工艺条件。采用多指标正交试验的变异系数分析方法[12-13]对总酸和感官评分两个指标进行计算得出综合评定值。

1.4.8 分析测定方法

1.4.8.1 常规指标测定

OD值测定：用7200可见分光光度计，在吸收光波长600 nm处测定；总酸：按照GB/T 12456—2008《食品中总酸的测定》，采用酸碱滴定法测定；pH：pH计直接测定；氯化钠：按照GB/T 12457—2008《食品中氯化钠的测定》，采用直接沉淀滴定法。

1.4.8.2 感官评价方法

将大头菜样品放置于一次性塑料碗中，由经过专业感官评价训练的评审员10人对大头菜的色泽(10分)、香气(40分)、滋味(40分)、脆性(10分)进行感官评分，共计100分[1, 4]。最后根据评分结果来确定大头菜质量，具体大头菜感官评分标准见表1。

表1 大头菜感官评分标准

2 结果与分析

2.1 优势菌群构建及发酵菌株比例优化

2.1.1 优势菌群构建

表2 接种发酵和自然发酵对大头菜产酸和感官评分的影响

注：同一列的不同字母表示在P<0.05水平差异显著。

接种发酵和自然发酵对大头菜产酸和感官评分的影响见表2。由于目前没有发酵大头菜的相关标准，考虑到大头菜质地上与榨菜相似，因此参照GB6094—1985《榨菜》和GHT1011—2007《榨菜》标准，结合大头菜自身半干态发酵的特点和工厂实际生产状况，确定大头菜出坛标准(即发酵成熟)为总酸含量(以乳酸计)5.40～10.0 g/kg。由表2可知，发酵90 d时，添加乳酸菌的大头菜样品酸度均达到了5.40 g/kg以上，对照组总酸含量仅为4.28 g/kg。当鼠李糖乳杆菌、肠膜明串珠菌、短乳杆菌3种菌混合使用时，发酵大头菜总酸含量最高，总体产酸更快，感官评分最高。单菌株发酵的大头菜与两菌株混合发酵大头菜总体总酸差异不显著(P>0.05)；而对照组的大头菜自然发酵90 d的总酸和感官评分与其他组总酸和感官评分相比差异显著(P<0.05)。通过综合比较，3种菌株混合使用产酸速度更快，感官评分更高。因此，下面对3种菌株混合进行进一步配比，以得出最佳配比结果。

2.1.2 发酵菌株比例优化

由表3可见，第4组总酸含量最高，其次为第8组、第1组、第2组；第8组感官评分最高，其次为第4组、第7组、第1组。通过显著性分析可知，第4组与第8组总酸含量差异不显著(P>0.05)，但感官评分差异显著(P<0.05)。因此，结合总酸和感官评价指标，鼠李糖乳杆菌∶肠膜明串珠菌∶短乳杆菌=3∶2∶3组合更有利于大头菜的发酵，可作为菌种最佳比例。

表3 不同混合菌株比例对大头菜产酸和感官评分的影响

注：同一列的不同字母表示在P<0.05水平差异显著。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 食盐浓度对大头菜发酵产酸和感官评价的影响

由图1可知，随着食盐浓度的增大，总酸含量逐渐降低，主要是因为乳酸菌活性受到抑制，使大头菜发酵产酸速度减慢，出坛时间延长。经过显著性分析可知，在发酵80 d时，感官评价结果差异显著(P<0.05)。通过感官评价发现，在8%的盐度下，其香气和滋味明显优于其他盐度，原因可能与8%盐度下微生物作用有关，既可以很好的抑制杂菌生长，又可以使大头菜口感酸咸适中，香气丰富。因此食盐用量应在既不影响乳酸发酵，又能抑制杂菌生长的范围内。因此，结合大头菜总酸和感官评价指标，选择食盐浓度8%为最佳。

图1 发酵大头菜的总酸和感官评分随食盐浓度的变化Fig.1 Change of fermentation kohlrbi’s total acid and sensory score with the salinity

2.2.2 乳酸菌接种量对大头菜发酵产酸和感官评价的影响

由图2可知，随着发酵的进行，总酸含量不断升高，在发酵80 d时，乳酸菌接种量为4%的条件下大头菜总酸含量最高，之后在5%的条件下大头菜总酸含量有所降低，这主要是由于乳酸菌添加量过多时，乳酸菌自身生长需要消耗大量的糖，但却减少了乳酸的生成[14]。在乳酸菌添加量为3%时，大头菜感官评分最高，此时大头菜总酸含量为5.62 g/kg。而且，接种量太高会造成大头菜香气与滋味较差，脆度低等不良影响，从而影响感官品质。因此，选择合适的接种量对大头菜发酵过程中产酸和感官评价至关重要，综上，选择3%作为大头菜发酵的较适接种量。

图2 发酵大头菜的总酸和感官评分随乳酸菌接种量变化Fig.2 Change of fermentation kohlrbi’s total acid and sensory score with the inoculation amount of lactic acid bacteria

2.2.3 发酵温度对大头菜发酵产酸和感官评价的影响

温度是影响大头菜发酵速度和质量的一个重要因素。由图3可知，发酵大头菜的感官评分随着温度的升高呈先升高后降低的趋势，27 ℃时感官评分最高，达到91.2分；在18 ℃时大头菜总酸含量仅为4.21 g/kg，感官评分为73.2分，原因主要是当发酵温度过低时，乳酸菌的生长代谢较慢，大头菜较易感染杂菌，从而不利于总酸的生成和品质的稳定[15]；之后随着温度的升高，乳酸菌生长代谢加快，逐渐成为优势菌群，总酸增长较快。综上，发酵温度选为27 ℃较为合适。

图3 发酵大头菜的总酸和感官评分随发酵温度的变化Fig.3 Change of fermentation kohlrbi’s total acid and sensory score with the fermentation temmper ature

2.2.4 发酵时间对大头菜发酵产酸和感官评价的影响

由图4可知，发酵大头菜产生的总酸含量随着发酵时间的延长呈增加趋势，感官评分随着发酵时间呈先升高后降低的趋势。发酵大头菜在70 d时已达到出坛标准，但随着发酵进行，其感官评分进一步增加，在80 d时达到最高。综上，发酵时间选为80 d较为合适。

图4 发酵大头菜的总酸和感官评分随发酵时间的变化Fig.4 Change of fermentation kohlrbi’s total acid and sensory score with the fermentation time

2.3 正交试验结果与分析

在单因素试验基础上，以食盐浓度、乳酸菌接种量、发酵温度和发酵时间为探讨因素，以总酸和感官评分为评定指标，进行4因素3水平的正交试验，正交试验结果与分析见表4。

由表4正交试验极差R可知，影响发酵大头菜因素顺序为：A>D>C>B，各因素的最佳组合为A2B1C2D3。由于该组合在正交试验的9组试验中出现，且此组合条件下综合评定值最高，因此不需要再做该组的验证试验。在该组合的工艺条件下，大头菜总酸为5.80 g/kg，感官评分为94.0分，故确定发酵大头菜的最佳工艺条件为：食盐浓度8%，接种量2%，发酵温度27 ℃，发酵时间90 d。

试验结果中，乳酸菌接种量(B)因素的极差R与其他因素差别较大，相比其他3个因素，此因素的影响较小。因此采用罗琳等[16]方法以极差最小的一项为误差项进行方差分析，方差分析结果表明发酵温度(C)和发酵时间(D)均对发酵大头菜有显著影响(P<0.05)，而食盐浓度(A)对其有极显著影响(P<0.01)。

表4 大头菜发酵正交试验结果

3 结论

选择鼠李糖乳杆菌(6001)、肠膜明串珠菌(6055)、短乳杆菌(6239)3株乳酸菌作为大头菜接种发酵的发酵剂，通过对发酵大头菜的优势菌群构建结果表明接种发酵组的总酸含量和感官评分明显高于自然发酵组，缩短了其发酵成熟期，提高了感官品质。其中3种乳酸菌混合发酵的总酸含量和感官评分高于其他乳酸菌发酵组。发酵大头菜混合菌株配比优化试验中，鼠李糖乳杆菌∶肠膜明串珠菌∶短乳杆菌=3∶2∶3组合的效果最佳，更有利于大头菜发酵。

由发酵大头菜的单因素试验得出：食盐浓度、乳酸菌接种量、发酵温度和发酵时间均对大头菜的品质有影响。在此单因素试验的基础上对大头菜的发酵条件进行正交试验工艺优化，经分析得知，大头菜发酵正交工艺优化试验中影响因素主次顺序为食盐浓度>发酵时间>发酵温度>乳酸菌接种量，其中发酵时间和发酵温度为显著性因素，食盐浓度为极显著因素。并根据各因素对发酵大头菜的总酸和感官评分的影响结果，确定了大头菜发酵的最佳工艺参数为：食盐浓度8%，接种量2%，发酵温度27 ℃，发酵时间90 d。在此条件下，发酵大头菜的滋味更加鲜美，香气更加纯正浓郁，此时大头菜总酸度平均值为5.80 g/kg，感官评分为94.0分。

[1] 吴希茜.大头菜后熟优势微生物分离鉴定及发酵剂的研制[D].重庆：西南大学, 2011.

[2] 汪兴平,莫开菊,李丽.低盐低酸大头菜加工技术研究[J].食品研究与开发, 2006, 27(1):66-69.

[3] 何金兰.大头菜的腌制工艺[J].热带农业科学, 2000(5):38-40.

[4] 王金美.大头菜新工艺及挥发性风味物质的研究[D].西南大学, 2010 .

[5] 刘达玉,董凯锋, 刘琴,等.大头菜人工接种发酵工艺及其成分分析[J].中国调味品, 2012, 37(7):21-26.

[6] Yuliana N, Garcia V V. Influence ofPediococcusacidilacticias a starter on the flavour of tempoyak (fermented durian)[J]. Indian Journal of Biotechnology, 2009, 304-310.

[7] 曾凡坤,罗晓妙.榨菜发酵腌制工艺改进研究[J].食品科学, 2009, 30(4):114-117.

[8] 燕平梅,薛文通,畅晓晖,等.自然发酵和接种发酵方法对白菜品质的影响[J].农业工程学报, 2008, 24(3):286-290.

[9] 山丽杰,田洪涛,马雯,等.几株保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在乳中发酵特性及优化搭配研究[J].中国乳业,2006(9):49-52．

[10] 张超,陈文兵,武道吉,等.混合菌修复石油污染土壤[J].化工环保, 2014, 34(1):19-23.

[11] 王巧.复合菌预处理秸秆产沼气试验研究[D].西安：西安工程大学, 2013.

[12] 胡庆国.毛豆热风与真空微波联合干燥过程研究[D].无锡：江南大学, 2006.

[13] 刘魁.烤烟品种综合评价方法研究[D].北京：中国农业科学院, 2011.

[14] 李纪涛.紫薯糯米酒酿造工艺研究[D].重庆：西南大学, 2015.

[15] 卢沿钢.胭脂萝卜纯种发酵泡菜及其保藏方式的研究[D].重庆：西南大学, 2013.

[16] 罗琳,窦志华,丁安伟,等.多指标正交试验优选复方五仁醇胶囊含药血清的制备方法[J].中草药, 2009, 40(2):238-241.

Optimization of strain ratio for turnips fermentation and related process

TANG Ling1, ZENG Xu-zhen2, ZHANG Jing1,ZHANG Bi-ying1, JIANG He-ti1*

1(College of Food Science, Southwest University, Chongqing 400715, China) 2(Chongqing Willie Agriculture Development Co., Ltd., Chongqing 404700, China)

Selecting appropriate fermentation condition is essential for acid production and sensory evaluation of turnip during its fermentation. Firstly, the combination of strains was optimized, and suitable strain ratio for turnip fermentation was determined asLactobacillusrhamnosus∶Leuconostocmesenteroides∶Lactobacillisbrevis=3∶2∶3 through construction of dominant bacteria and optimization experiment for proportion of strains fermentation. Then turnips were used as raw materials to carry out fermentation inoculated with lactic acid bacteria. Using single factor experiment and the orthogonal experiment, the optimum fermentation condition for turnips was determined as follows: lactic acid bacteria (L.rhamnosus∶L.mesenteroides∶L.brevis=3∶2∶3) inoculum was 2%, the salt concentration was 8%; the fermentation temperature was 27℃, and the fermentation time was 90 d.

kohlrabi;lactic acid bacteria; fermentation; strain ratio;process optimization

10.13995/j.cnki.11-1802/ts.201701015

硕士研究生(蒋和体教授为通讯作者,E-mail：jheti@126.com)。

重庆市“121”科技支撑示范工程(cstc2013jcsf-jcssX0033)

2016-06-08，改回日期：2016-09-09