运动补剂对不同运动方式下骨骼肌自噬的影响

张殿福

（内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古包头014109）

运动补剂对不同运动方式下骨骼肌自噬的影响

张殿福

（内蒙古农业大学职业技术学院，内蒙古包头014109）

通过建立跑台运动和负重游泳运动的小鼠模型，分析研制的运动补剂对小鼠骨骼肌自噬相关基因LC3、Atg7、Atg9和Beclin1的影响。运动补剂采用玛咖提取物、燕麦提取物、亨育宾提取物、L-精氨酸-α-酮戊二酸盐和蛋白等营养物质制备，经灌胃的方式使小鼠服用，之后检测跑台运动和负重游泳运动后骨骼肌自噬相关基因的表达水平.与安静组相比，跑台运动组和负重游泳运动组小鼠在不服用运动补剂的时候均可以提高小鼠骨骼肌细胞的自噬水平（P＜0.05），其中负重游泳运动提升自噬水平更明显。而在摄入运动补剂后，小鼠骨骼肌自噬水平再次提高，其中负重游泳运动配合运动补剂的方式上升最为明显（P＜0.01）。证明我们所制备的运动补剂对提高小鼠骨骼肌细胞自噬水平存在上调作用，而与无氧运动组合后提升效果更明显。

运动补剂；小鼠；骨骼肌；自噬

肥胖严重影响我国人民的身体健康，除了控制饮食，减少热量摄入，合理的运动训练可以显著提高减肥效果。在运动训练中摄入运动补剂的研究逐步开展，大量的研究已经证明，运动补剂可以提高运动训练的效率，并提供一定的安全性[1]。细胞自噬是一种普遍存在于病理和正常状态细胞的重要周转过程，脂质过氧化物、损伤的细胞器、衰老的蛋白质和游离的不明物质等被双层膜包裹，再通过与细胞内的溶酶体结合，对内容为进行降解处理，之后再形成生物大分子再被吸收，完成物质的回收利用[2]。生物体内的自噬过程对于细胞内环境稳态、发育、分化和生存有着明显调节作用，而且当机体发生应激突发反应时，细胞自噬可以作为一种保护手段，提高健康细胞的代谢活性和存活几率[3]。研究指出多种刺激均可以引起小鼠骨骼肌自噬水平的变化，如机体氧化应激、蛋白质异常积累、能量匮乏等，这些刺激方式与不同运动方式产生的刺激相接近，均可以影响人体在运动过程中的表现[4]。对于阻抗运动和有氧运动的研究，均证实在这些运动过程中可以明显上调小鼠骨骼肌内的自噬水平，提高骨骼肌细胞的代谢效率，但是这种上调状况存在明显差异，这一现象必然影响骨骼肌细胞的代谢活性，影响运动后的恢复效果[5-6]。在运动过程中，骨骼肌细胞对于营养物质和能量需求较大，那么实时补充运动补剂，是否可以使骨骼肌细胞处于自噬反应增强的状态，进而维持较强的代谢水平。因此，本研究在不同种类的小鼠运动训练模型中使用自主研发的运动补剂进行补充，分析这种组合模式对小鼠骨骼肌肉自噬水平的影响情况。

1 材料与方法

1.1 运动补剂的制备

参考市场上主流的运动补剂配方进行设计，具体配方如下：每100 mL运动补剂中蛋白质（33 g）、糖（2 g）、膳食纤维（1 g）、玛咖提取物（2%）、燕麦提取物（2%）、亨育宾提取物（2%）、L-精氨酸-α-酮戊二酸盐（L-Arginine-α-Ketoglutarate）（1%）、维生素、微量元素和无机盐共1 g。

1.2 仪器

SJ-CJ-1FDQ单面工作台：苏州苏净；AL104电子天平：梅蒋勒－托利多仪器；ZH-PT小鼠跑台：安徽正华生物仪器；DJ-XSC小鼠恒温泳池：上海继德教学实验器械；TG-16高速低温冷冻离心机：湖南湘仪；ABI 7500荧光定量PCR仪：Life。

手术刀，无菌操作台。

1.3 实验动物及分组

4周龄清洁级ICR雄性小鼠150只，体重（33.6± 3.21）g，随机分成5组，每组30只小鼠，分为：安静组，跑台组，负重游泳组，跑台+运动补剂组和负重游泳+运动补剂组。

1.4 运动方案

根据分组情况，设定实验方案，具体情况见表1。其中安静组小鼠作为对照组，不进行任何运动，按照标准饲养程序饲养。跑台组在训练过程中，观察小鼠状态，特别是运动心态；负重游泳组在游泳过程中，避免发生溺水事件。进行运动补剂摄入的实验组，每日严格称量小鼠体重，按照方案要求摄入新鲜配制的运动补剂。

1.5 骨骼肌自噬水平检测

1.5.1 训练2周后，开始进行测试，所有训练小鼠按照训练计划方法进行力竭训练。

表1 运动训练方案情况Table1 Sport training plan

1.5.2 动物处死与取材

所有动物在实验结束后立即处死，迅速取下双侧下肢腓肠肌，称重后放入冻存管，置于液氮中保持，20min后转移至-80℃冰箱备用。

1.5.3 Real-time PCR检测

1.5.3.1 总RNA的提取与鉴定

取冻存的腓肠肌，取材后采用Trizol法提取总RNA，具体步骤按照说明书进行。采用紫外分光光度计对提取的总RNA进行测量，总RNA根据实验需求采用DEPC水稀释，选合适浓度之后进行逆转录反应。根据待检测基因，设计引物，引物设计结果如表2所示。

表2 引物设计Table2 Primers design

1.5.3.2 逆转录反应

具体的逆转录过程如下：取5μL样品RNA，5ⅹRT-PCR Buffer 2μL，RTEnzyme Mix 0.5μL，无RNA酶水2μL，反应条件如下：37℃15min，98℃5min。反应结果放于-20℃冰箱中备用。

1.5.3.3 Real-timePCR

具体的Real-timePCR体系如下：总体积20μL，cDNA产物2μL，SYBR green PCRMaster Mix 10μL，引物0.8μL，PCR水6.4μL。

具体的反应步骤如下：1）95℃60 s，进行预变性；2）95℃15 s→61℃30 s→72℃45 s，共计40个循环；3）建立溶解曲线，进行95℃15 s变性、55℃60 s退火，之后15 s内从55℃逐步加热到95℃，每1个℃变化收集一次荧光信号。

根据溶解曲线主峰情况，分析扩增的特异性。反应结束后，根据软件输出的CT值，结合β-actin数值，分析各个目的基因的表达水平。

1.6 不良反应事件分析

观察所有参与实验的小鼠在实验过程中的状况，如出现死亡等情况要做出详细分析。

1.7 数据处理

所有数据的统计分析均采用spss18.0，计量资料进行采用t检验，计数资料采用x2检验，P＜0.05为差异显著，具有统计学意义。

2 结果与分析

2.1 骨骼肌自噬相关基因表达情况分析

经检测各组小鼠自噬相关基因表达的表达水平如表3所示。

表3 LC3、Atg7、Atg9、Beclin1基因表达情况Table3 Gene expression of LC3，Atg7，Atg9，Beclin1

与安静组相比较，跑台组小鼠Atg7和Beclin1均发生明显的表达水平上调，其中Atg7上调差异显著（P＜0.05），Beclin1差异极显著（P＜0.01），与负重游泳组相比，跑台运动不能显著提高各项基因；而与摄入补剂后的跑台运动组相比，各项基因表达水平减少，证明运动补剂可以提高跑台运动小鼠的骨骼肌细胞自噬水平。与安静组相比较，负重游泳组小鼠Atg7、Atg9和Beclin1均发生明显的表达水平上调，其中Atg7上调差异显著（P＜0.05），Atg9和Beclin1差异极显著（P＜0.01），而与摄入补剂后的游泳运动组相比，各项基因表达水平减少，证明运动补剂可以提高负重运动小鼠的骨骼肌细胞自噬水平。与安静组相比较，跑台+运动补剂组和负重游泳+运动补剂组小鼠LC3、Atg7、Atg9和Beclin1均发生明显的表达水平上调，四项指标均存在差异极显著（P＜0.01），同时与未摄入补剂的实验组相比，各个相关基因表达水平同样发生显著增加（P＜0.05）。

2.2 不良反应事件分析

在训练和测试过程中，各组实验小鼠均未发生任何不良反应事件，均正常完成训练和实验。

3 讨论

细胞自噬过程是指在溶酶体的作用下使细胞内自身细胞器和大分子物质发生自身降解，这种细胞在面临代谢压力的情况下，发挥的一种提高环境适应性的调节机制，对维持细胞内稳态有着积极意义。同时对于人或动物的运动来说，自噬可以提高对糖类物质的利用率，进一步提高人或动物的运动水平，促进人类健康[7]。骨骼肌细胞发生自噬，可以有效提高细胞内线粒体的产生和质量，持续对机体的持续供能和健康维护[8]。目前，已经有少量报道指出不同的运动模式，对于骨骼肌细胞自噬水平存在一定影响[8]，但是对于运动补剂是否通过调剂细胞自噬水平或激活细胞自噬信号达到提高机体运动能力的研究鲜有报道。

我们参考市面主流运动补剂配方，结合本实验室多年研究，开发的运动补剂含有丰富营养成分和大量生物活性物质，但功能并不明确。因为从分子机制上讲，细胞自噬可以改善谷歌肌细胞内的抗氧化和能力代谢，因此有研究指出，采用分析小鼠骨骼肌，特别是腓肠肌和比目鱼肌细胞的自噬水平方法，对运动补剂缓解运动性疲劳、提高运动能力和改善运动适应性的研究有积极意义[9-10]。因此在本研究中，我们采用Realtime PCR的方法分析小鼠骨骼肌中自噬相关基因的表达水平。其中，关于LC-3、Atg7、Atg9和Beclin1的mRNA的检测结果显示在无氧运动（负重游泳）较有氧运动（跑台训练）可以明显的基因的表达水平，说明无氧运动对LC-3、Atg7、Atg9和Beclin1的mRNA的表达可以造成显著性影响。而在摄入运动补剂后，LC-3、Atg7、Atg9和Beclin1在摄入补剂组较安静对照组、跑台组和负重游泳组发现显著性提高，证明本研究所制备的运动补剂对于提高骨骼肌细胞的自噬水平有显著性影响。

通过本研究，证明我们所开发的运动补剂可配合有氧运动或无氧运动，达到通过提高骨骼肌细胞自噬相关基因的表达水平的目的。

参考文献：

[1]吴超,张海信.大强度耐力训练抗氧化运动补剂研究进展[J].赤峰学院学报(自然科学版),2013(11):136-137

[2]刘娜,董晓莉,叶俊丽,等.细胞自噬诱导剂雷帕霉素对小鼠小胶质细胞线粒体ROS表达及炎性细胞因子分泌水平的影响[J].山东医药,2016,56(27):33-35

[3]王海杰,谭玉珍.细胞自噬的形态学特征和功能意义[J].解剖学报,2009,40(5):844-849

[4]王平,LIChunguang,漆正堂,等.急性递增负荷运动对小鼠骨骼肌SOD同工酶活性和mRNA表达的影响[J].成都体育学院学报, 2016,42(3):116-121

[5]邱守涛,崔迪,付绍婷,等.不同强度耐力运动对骨骼肌质量的影响:自噬与衰老[J].沈阳体育学院学报,2015,34(1):78-84,90

[6]于亮,周越,陈晓萍,等.一次性力竭运动小鼠骨骼肌AMPK活性变化对自噬水平的影响[J].武汉体育学院学报,2015,49(3):91-95

[7]李红园,魏丽娟,魏占勇,等.细胞自噬的研究进展[J].畜牧与兽医, 2015,47(5):143-146

[8]贾绍辉,刘君,寇现娟,等.运动诱导的细胞自噬对小鼠心肌的保护作用[J].武汉体育学院学报,2014(10):53-56

[9]崔迪,邱守涛,王海燕,等.耐力运动对营养性肥胖小鼠骨骼肌细胞自噬及线粒体自噬的影响[J].体育科学,2014(12):63-71

[10]卞龙艳,蒋丹,林芳,等.运动对成年小鼠肌肉氧自由基和自噬水平的影响[J].苏州大学学报(医学版),2012,32(4):510-513

Sports Supplement Cooperation on Different Sports Modes on Skeletal Muscle Autophagy

ZHANG Dian-fu
（Vocational and Technical College of Inner Mongolia Agricultural University，Baotou 014109，Inner Mongolia，China）

By establishing a mouse model of treadmill exercise and loading swimming sports，analysis the effect of sports supplement in LC3，Atg7，Atg9，Beclin 1 of mice skeletal muscle autophagy-related genes.Sports supplements prepared using Maca extract，oat extract，Corynante Yohimbe extract，L-arginine-α-ketoglutarate and protein and other nutrients.The mice eated sports supplement by lavage，and detected the autophagy-related gene expression level in skeletal muscle after the treadmill Exercise and after swimming exercise.Compared with the quiet group，treadmill exercise group and the loading swimming exercise group can improve the autophagy level of mice skeletal muscle cells（P＜0.05），in which the swimming motion to enhance the level of autophagy more obvious.And after taked sports supplements，the level of skeletal muscle autophagy was increased again，where loading swimming sports with sports supplements were increased more obviously（P＜0.01）. The result proved that sports supplements play a role in the increase the presence of skeletal muscle cell autophagy level，and supplements combination with anaerobic exercise could enhance skeletal muscle cell autophagy level more obviously.

sports supplements；mouse；skeletal muscle；autophagy

10.3969/j.issn.1005-6521.2017.03.043

2016-09-13

张殿福（1972—），男（汉），副教授，硕士，研究方向：体育教育训练学。