急性高原低压缺氧对成年大鼠海马齿状回细胞增殖和分化的影响※

祁存芳，闫 帅，何 敏，刘 芳，唐延军，黄明玉

(1.青海大学医学院基础医学部，基础医学实验中心，青海 西宁 810001；2.解放军第四医院内科，青海 西宁 810007)

大量实验研究发现，成体哺乳动物脑内存在神经干细胞(neural stem and cells，NSCs)巢，NSCs在嗅球、皮层、室管膜区或室管膜下区(subventricular zone，SVZ)、纹状体(striatum)、齿状回(dentate gyrus，DG)颗粒细胞下区(Subgranular zone，SGZ)等组织中存在，NSCs具有自我增殖和潜在分化的能力。正常生理情况下，SVZ和SGZ仅有少量神经发生，以补偿生理的损失量。但在某些病理条件如脑缺血的情况下，SVZ和SGZ的NSCs被激活，促进其自我增殖，并分化为神经元整合到神经元网络，发挥自我修复作用。高海拔环境是一个相对缺氧的环境，目前对急性高原缺氧导致的海马颗粒细胞变性坏死或凋亡的研究有许多报道，但急性高原缺氧刺激对海马齿状回NSCs影响的研究报道很少，且结论不一。本研究采用低压氧舱模拟海拔5 000米高原环境，观察大鼠初次从海拔400米急进5 000米环境持续滞留3天，返回到海拔2 200米环境后，观察急性低压缺氧刺激对大鼠海马齿状回颗粒下区神经干细胞增殖和分化的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 动物

SD雄性大鼠120只，体重约280～310 g，由西安交通大学医学实验动物中心提供，清洁级，动物合格证号No. 22-9601018。

1.1.2 试剂

5-溴脱氧尿核苷(5-bromodeoxyuridine，BrdU)购于Sigma公司，抗BrdU小鼠单克隆抗体购于CST公司，抗双皮质素(Doublecortin，DCX)兔单克隆抗体购于Abcam公司，抗胶质纤维酸性蛋白(Glial FibrillaryAcidic Protein，GFAP)兔多克隆抗体购于Thermo公司，SABC试剂盒购于武汉博士德公司，生物素标记羊抗鼠/兔IG、FITC/Cy3标记荧光二抗购于北京康为公司。

1.2 方法

1.2.1 高原缺氧损伤模型的建立和组织取材

动物随机分组：高海拔预处理组经模拟5 000米海拔低压氧舱预处理3天，转移至海拔2 200米环境行常规饲养；对照组在海拔2 200米环境行常规饲养，分别在常规饲养1、3、7、14、28天后行组织取材。

1.2.2 BrdU标记

将10 mg/mL浓度的BrdU溶于0.9%氯化钠溶液中，配置成1%的溶液，行BrdU腹腔注射(50mg/kg每天注射3次，连续注射3天)。

1.2.3 BrdU免疫组织化学染色

1.2.4 BrdU/DCX、BrdU/GFAP免疫荧光双标染色

组织切片脱蜡、水化，抗原热修复和BrdU变性、封闭等步骤同免疫组化染色步骤。

1.2.5 统计学处理

2 结果

2.1 BrdU阳性细胞分布和计数

BrdU阳性细胞细胞核呈深染的棕色或黄色颗粒状，低压缺氧损伤后，在海马齿状回的门区和周围出现较多的BrdU免疫阳性反应细胞(图1A，C)。海马齿状回颗粒细胞下层有典型的BrdU免疫阳性细胞表达(图1B，D)。BrdU阳性细胞计数结果显示：低压缺氧激活SGZ的NSCs增殖，低压缺氧损伤后第3天和7天，实验组阳性细胞计数显著高于对照组(P<0.001)；低压缺氧损伤后第14天，实验组阳性细胞计数明显高于对照组(P<0.01)(表1 )。

A：对照组海马齿状回BrdU阳性细胞分布；B：图A中框选区放大图像，箭头指示SGZ的BrdU阳性细胞；C：实验组海马齿状回BrdU阳性细胞分布；D：图C中框选区放大图像，箭头指示SGZ的BrdU阳性细胞

图1低压缺氧刺激后大鼠齿状回BrdU阳性细胞表达图

Figure1ExpressionofBrdUpositivecellsinhippocampusdentategyrusofratsafterhypobarichypoxia

表1低压缺氧刺激后不同时间点大鼠齿状回BrdU阳性细胞计数表

Table 1 The number of BrdU positive cells in hippocampus dentate gyrus of rats at different time after hypobaric hypoxia

2.2 BrdU/DCX免疫荧光染色和阳性细胞计数

为了观察低压缺氧对增殖NSCs向神经元方向分化的影响，采用免疫荧光双标染色法检测未成熟神经元标记蛋白DCX和BrdU的共表达。结果显示，DCX免疫阳性细胞主要分布于颗粒细胞下层，海马齿状回的门区有少量DCX阳性细胞(图2 A-H)，在低压缺氧损伤后第14天和28 天，颗粒细胞层有少量DCX阳性细胞表达(图2 I，J)，阳性细胞计数结果显示，低压缺氧促进SGZ未成熟神经元增殖，低压缺氧损伤后第1天和7天实验组SGZ DCX免疫阳性细胞数高于对照组(P<0.05)；低压缺氧损伤后第3天实验组SGZ DCX免疫阳性细胞数显著高于对照组(P<0.001)(表2)。统计BrdU/DCX双标阳性细胞占所有BrdU阳性细胞的比例，实验组双标阳性比例介于85.4%～89.2%，对照组双标阳性比例介于82.6%～88.3%，统计学分析显示各时间点实验组和对照组比较没有显著性差异(表3)。

A：对照组海马齿状回DCX阳性细胞主要分布于颗粒细胞下层；B：对照组海马齿状回BrdU阳性细胞分布于颗粒细胞下层；C：对照组BrdU和DCX在海马齿状回共表达；D：框选C图的放大图像，箭头指示双标阳性细胞；E：实验组海马齿状回DCX阳性细胞主要分布于颗粒细胞下层；F：实验组海马齿状回BrdU阳性细胞分布于颗粒细胞下层；G：实验组BrdU和DCX在海马齿状回共表达；H：框选G图的放大图像，箭头指示双标阳性细胞； I：低压缺氧损伤后第14 d，箭头指示海马齿状回颗粒细胞层有BrdU和DCX双标阳性细胞；J：低压缺氧损伤后第28 d，箭头指示海马齿状回颗粒细胞层BrdU和DCX双标阳性细胞

图2低压缺氧刺激后大鼠海马齿状回DCX阳性细胞表达和分布图

Figure2ExpressionanddistributionofDCXpositivecellsinhippocampusdentategyrusofratsafterhypobarichypoxia

表2低压缺氧刺激后不同时间点大鼠齿状回DCX阳性细胞计数表

Table 2 The number of DCX positive cells in hippocampus dentate gyrus of rats at different time after hypobaric hypoxia

表3低压缺氧刺激后不同时间点大鼠齿状回BrdU/DCX双标阳性细胞比例表

Table 3 The ratio of BrdU/DCX double positive cells in the hippocampus dentate gyrus of rats at different time after hypobaric hypoxia

2.3 BrdU/GFAP免疫荧光双标染色和阳性细胞计数

为了观察低压缺氧刺激对增殖NSCs向胶质细胞方向分化的影响，采用免疫荧光双标染色法检测星形胶质细胞标记蛋白GFAP和BrdU的共表达。结果显示，GFAP免疫阳性细胞分布广泛，在海马齿状回颗粒细胞周围有大量GFAP免疫阳性表达，在颗粒细胞下层有少量GFAP免疫阳性表达(图3 A-H)。阳性细胞计数结果显示，低压缺氧促进胶质细胞增殖，低压缺氧损伤后第1天和3天实验组齿状回GFAP免疫阳性细胞明显多于对照组(P<0.001)(表4)。统计BrdU/GFAP双标阳性细胞占所有BrdU阳性细胞的比例，结果显示低压缺氧损伤后第1天和7天实验组双标阳性率高于对照组(P<0.05)，低压缺氧损伤后第3天实验组双标阳性率明显高于对照组(P<0.01)(表5)。

A：对照组海马齿状回GFAP细胞广泛分布于海马齿状回周围组织；B：对照组BrdU阳性细胞分布于海马齿状回颗粒细胞下层和周围组织；C：对照组BrdU和GFAP在海马齿状回共表达；D：框选C图的放大图像，箭头指示双标阳性细胞；E：实验组海马齿状回GFAP阳性细胞表达和分布；F：实验组海马齿状回BrdU阳性细胞表达和分布；G：实验组BrdU和GFAP在海马齿状回共表达；H：框选G图的放大图像，箭头指示双标阳性细胞

图3低压缺氧刺激后大鼠海马齿状回GFAP阳性细胞表达和分布图

Figure3ExpressionanddistributionofGFAPpositivecellsinhippocampusdentategyrusofratsafterhypobarichypoxia

表4低压缺氧刺激后不同时间点大鼠齿状回GFAP阳性细胞计数表

Table 4 The number of GFAP positive cells in hippocampus dentate gyrus of rats at different time after hypobaric hypoxia

表5低压缺氧刺激后不同时间点大鼠齿状回BrdU/GFAP双标阳性细胞比例表

Table 5 The ratio of BrdU/GFAP double positive cells in the hippocampus dentate gyrus of rats at different time after hypobaric hypoxia

3 讨论

高海拔地区空气稀薄，大气压和空气中氧气分压明显低于低海拔地区，海拔5 000米时大气压强为53.732 Kpa，约为海平面的55%左右，而空气含氧量比零海拔下降8%，约为12.95%，是零海拔含氧量的61.8%。当我们初次进入高海拔地区后，机体各系统器官结构对高海拔低压缺氧刺激产生不同的反应表现，其中中枢神经系统对高海拔低压缺氧反应敏感，轻度缺氧时，整个神经系统兴奋性增强，生理表现为紧张、激动、头痛、失眠、健忘等，海拔继续升高时神经系统则由兴奋转入抑制，出现神志不清、反应迟钝、食欲不振等不良反应。海马组织结构及齿状回的神经元活性和纤维联系在学习记忆功能正常发挥中有重要作用，而海马组织细胞对缺氧极度敏感，研究显示，低压缺氧严重影响脑组织结构和功能，特别是神经认知功能和空间记忆能力[1]。严重缺氧导致海马细胞变性、坏死，并促进海马细胞凋亡，对学习记忆功能造成损伤，而这种损伤在以往的经验中认为是不可逆不能修复的。但随着近十多年来对成体脑内NSCs研究的不断深入发现，成年哺乳动物的中枢神经系统中存在着具有增殖和分化潜能的多能干细胞，它们具有多向分化、高度增殖的能力，经过对称分裂和不对称分裂可以产生新的NSCs和神经前体细胞，而所产生的神经前体细胞进而可以分化成具有特定功能类型的神经元和神经胶质细胞，可维持局部神经网络的完整和更新[2，3]。研究发现海马齿状回颗粒细胞下区是NSCs富集区，生理条件下就有少量干细胞增殖、迁移，分化为功能细胞，用以补充生理丢失量[4，5]。而且在多种病理情况下，如脑缺血[6，7]和阿尔茨海默病[8，9]、抑郁症[10，11]、精神分裂症[12]等，海马齿状回SGZ的NSCs进入到神经发生进程，通过干细胞增殖、迁移和定向分化，可以补充损失的神经细胞，进而改善和修复损伤的神经功能。

神经发生是细胞本身内部基因的调控和细胞外各种刺激因素相互作用与调节的结果。影响海马神经发生过程受各种因素的调节，包括神经营养因子、炎症因子、细胞周期调控因子和神经递质及激素等，这些调节因素通过多种信号通路发挥作用。低压缺氧刺激诱导机体出现应激反应，近年来研究发现，应激反应是神经发生最重要的调节因素[13]。我们采用BrdU标记技术，观察在模拟海拔5 000米环境下，急性低压缺氧刺激对SGZ NSCs神经发生的影响。BrdU是一种嘧啶类似物，在细胞周期S期DNA的合成中可以掺入到DNA链中。并随着DNA的复制延续到新的增殖细胞中，因此常作为增殖细胞的标记物。实验结果显示，急性低压缺氧损伤后，SGZ出现NSCs的增殖，增殖细胞数明显高于对照组，虽然增殖细胞的总体数量较少，但增殖周期一致持续到损伤后14天。进一步我们采用免疫荧光双标染色技术，观察DCX/BrdU和GFAP/BrdU双标染色情况，分析增殖细胞的分化能力和分化方向，其中DCX是未成熟神经元的标记物，GFAP是星形胶质细胞标记物。结果显示，低压缺氧刺激促进SGZ的DCX阳性细胞表达，在SGZ，BrdU/DCX双标阳性细胞占所有BrdU阳性细胞的比例接近90%，而且在颗粒细胞层也发现少量双标阳性细胞。结果提示，新增殖的细胞大部分向神经元方向分化，并可以向颗粒细胞层迁移。在低压缺氧损伤后1～3天，BrdU阳性细胞除了在SGZ表达，在海马的其他区域也大量出现，而GFAP也在低压缺氧损伤后1～3天在海马颗粒细胞周围大量表达，BrdU/GFAP双标阳性细胞虽然在SGZ很少见，但在海马神经元周围有较多的双标阳性细胞，而且这些双标阳性细胞高表达持续时间比较短暂。分析结果，在海马齿状回周围大量的BrdU/GFAP双标阳性细胞应该是反应性增殖的星形胶质细胞，而在SGZ，BrdU/GFAP 双标细胞数量很少。结果提示，增殖干细胞向胶质细胞方向分化比例低。

高原低压缺氧应激刺激调节神经发生的机制涉及多个方面，首先，缺氧应激激活肾上腺糖皮质激素信号途径，产生的糖皮质激素穿过血脑屏障与大脑许多区域的糖皮质激素受体和盐皮质激素受体结合发挥负反馈性调节作用。研究发现，在海马齿状回有广发分布的糖皮质激素受体和盐皮质激素受体，但在在体和体外实验发现，海马部分前体细胞中只有糖皮质激素受体而没有盐皮质激素受体[14]，而实验性敲除小鼠SGZ 区的糖皮质激素受体，SGZ 区神经细胞增殖和分化增多[15]。糖皮质激素和受体结合后调节下游的相关基因，通过基因转录分析表明大量的信号通路受到影响，其中包括与成体神经发生密切相关的信号通路，譬如Hedgehog 信号通路和TGF-β信号通路[16，17]等。其次，缺氧诱导因子(hypoxia-inducible factor1，HIF-1)是一种缺氧应激性产物，在缺氧刺激后，稳定表达的HIF-1激活其下游基因的表达[18]，其中包括VEGF、EPO、iNOS等超过100个下游基因的表达[19，20]。有这些基因编码的蛋白参与多种病理生理过程：包括葡萄糖转运及酵解；红细胞生成；氧化应激反应；促炎或抗炎反应；血管新生与重塑，以及中枢和周围神经再生等。实验发现，在相对缺氧环境下，在SVZ、SGZ，BrdU阳性细胞数都明显高于常氧环境；敲除HIF-1α 基因的大鼠生理状态下NSCs数量可减少近50%[21]，结果提示干细胞增殖和HIF-1α的表达相关。缺氧应激还可以通过调节Shh蛋白和Wnt蛋白等决定细胞分化和调节成体神经发生的形态发生因子，可以激活SHH和Wnt信号通路，进而调节成体神经发生。此外，缺氧刺激影响炎性分子等细胞因子和BDNF等神经营养因子的分泌，进而通过相应的信号分子调节成体神经发生。

总之，急性低压缺氧刺激可能通过多种途径激活海马齿状回颗粒细胞下区NSCs的增殖，并促进新生前体细胞向神经元方向分化，虽然存在增殖细胞数量较低，并且能够存活下来整合到损伤神经网络的细胞也较少，但其潜在的内源性修复作用对缺氧应激性脑损伤有一定的替代治疗和脑保护作用。在今后的研究中，进一步深入探索急慢性低压缺氧刺激后神经发生的调节机制，可为此类疾病的治疗和药物开发提供作用靶点。

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