天然活性多糖研究进展

张淑杰,康玉凡

(中国农业大学农学院,北京 100193)

天然活性多糖研究进展

张淑杰,康玉凡*

(中国农业大学农学院,北京 100193)

天然多糖是由许多相同或不同的单糖以糖苷键连接而成的多聚物,具有促进免疫调节、抗肿瘤及降血糖等功能。由于活性多糖安全、无毒,在医药、农业、食品等方面具有广阔的开发应用价值与前景,现已成为国内外众多学科领域研究的热点。本文对近5年国内外天然活性多糖的提取、纯化及生物活性等的研究进展进行系统地综述。

活性多糖,提取,纯化,生物活性

多糖(polysaccharide)亦称多聚糖,是由二十多个到上万个单糖组成的天然高分子化合物[1],广泛存在于动植物、真菌和微生物体中。天然多糖根据其来源,可以被划分为微生物多糖(真菌与细菌多糖),中低等植物多糖(藻类为主)和高等植物多糖(如果胶、淀粉、纤维素、半纤维素等),动物中的甲壳质、粘性物质、糖原、硫酸软骨素等[2]。根据组成单糖的类别,可以将多糖划分为均聚多糖、杂多糖、糖缀合物三大类[3]。

糖类不仅可以作为一种能量物质和结构成分,还有一部分多糖可以参与细胞的代谢及生理调节。近年来,关于活性多糖的生物功能的报道主要包括多糖的抗肿瘤、降血脂、抗病毒、提高免疫功能等[4]。目前,多糖作为一种天然活性成分因其具有多种生物活性,且无毒、无害、无残留、无抗药性作用,备受国内外研究者青睐,是医药、农业、食品等研究领域的热点。本文从提取、分离纯化、生物活性等方面将天然活性多糖近几年的国内外研究进展进行系统综述,为今后开展天然活性多糖的深入研究及应用开发提供理论参考价值。

1 天然活性多糖的提取

目前多糖的提取方法主要有溶剂提取法[5]、酸提法、碱提法、酶解法、超声法、微波法[6]、超高压提取法、超临界流体萃取法等。

1.1 溶剂提取法

多糖分子属于极性大分子,呈弱酸性。因此在利用溶剂法提取多糖时,常常选择水、醇等极性较强的溶剂作为提取剂。溶剂的极性越强,多糖的得率越高[7]。首先要根据多糖的存在形式及提取部位不同,决定在提取之前是否做预处理。用水做溶剂提取多糖时,提取液的温度对多糖的得率影响较大且复杂。高温往往会造成蛋白质变性失活、糖链降解等,而提取液温度太低时,多糖的溶出较为困难,从而导致多糖得率降低。

表1 天然活性多糖的提取方法比较Table 1 Comparison on the methods of bioactive polysaccharides

1.2 酸碱提取法

酸碱提取法主要是利用细胞在酸液或碱液中会吸水溶胀以致破裂,使细胞中的活性物质释放出来。该法对提取条件要求较高,需要控制好提取酸碱度、时间、温度,避免引起多糖水解,改变多糖结构,影响得率[8]。Oliveira[9]对酸解法制备香蕉皮多糖工艺进行优化,得到最佳工艺条件下多糖得率高达40%;Siu等人[10]利用碱法提取蜜环菌多糖,得到最高多糖得率3.30%。

1.3 酶解法

酶工程技术是近年来发展起来的新型破壁提取方法,酶法提多糖具有专一性强、作用条件温、高效快速、多糖得率高且有效保持多糖的活性等优点,已广泛用于植物有效成分的提取[11]。何传波等人[12]采用纤维素酶法辅助提取枇杷叶多糖,得到提取最佳条件为时间2.95 h、提取温度41 ℃、酶用量15.6 mg/g,多糖提取率高达8.03%。

1.4 微波提取法

微波法利用高频电磁波进入活性物质原料,快速转化为热能使细胞内温度极速升高,细胞内外压力差过高,导致细胞壁破裂,细胞内容物流出,在外部低温下溶解于萃取的媒质,之后进一步分离纯化,获得提取物[13]。任花[14]利用微波辅助法从豆渣中提取水溶性多糖,通过优化实验确立最佳提取工艺参数下得率为6.64%。Yin等人[15]采用超声-微波辅助法优化提取多糖工艺,得到最佳工艺条件下多糖得率高达11.38%。

1.5 超声提取法

超声波辅助提取技术,作为一种新型高效分离提取技术在多糖提取等方面得到广泛应用[16-18]。黎英[11]采用超声辅助提取法对红腰豆多糖提取工艺进行优化,得到最佳工艺超声功率400 W,超声时间34.0 min条件下红腰豆多糖得率14.15%,此工艺对应用于工业化生产,推广价值高,具有很好的应用前景。

1.6 超高压提取法

在一定程度上细胞壁阻碍胞内多糖的提取，提取天然植物细胞内多糖时,利用超高压力使细胞壁破裂，内部有效成分释放和溶出,容易分离纯化[19]。陈三娜[20]采用超高压处理杏鲍菇,在压力450 MPa,时间10 min条件下,杏鲍菇片总糖含量为0.5%。王新新[21]采用超高压方法对瓜蒌多糖最佳提取工艺进行优化,得到最佳条件,瓜蒌多糖的提取率达19.11%。

1.7 超临界萃取法

相比于传统多糖提取方法,还有超临界流体萃取法等新兴提取方法。张艳荣[22]采用超临界辅助热水浸提法提取人参多糖,正交实验确定提取人参多糖的最佳工艺条件,优化条件下人参多糖提取率为38.03%±1.43%,多糖纯度为54.71%±2.16%,两者得到显著提高。近年来,随着科技进步,联合提取方法将多种方法结合提取多糖,能大大加速多糖的溶出,通过响应面法优化工艺达到最优的提取效果[23,24]

2 多糖的分离纯化

2.1 多糖的初级纯化

2.1.1 脱蛋白处理 目前,脱除蛋白质的方法主要有:Savag 法、TCA法、酶法等。

表2 天然活性多糖常见脱蛋白方法比较Table 2 The comparison in common deproteinization method of bioactive polysaccharides

2.1.1.1 Savag法 Savag法是一种比较广泛使用的脱蛋白方法。Savag 试剂为氯仿与正丁醇按4/1～5/1的体积比配制的,蛋白质在Savag试剂中变性为白色凝胶物析出。张贺[25]利用Savag 法脱蛋白确定最佳实验条件下蛋白脱除率为46.31%,多糖损失量为8.16%。孔繁东[26]通过酶-Savag结合法,得到玉竹多糖保留率为91.9932%,蛋白清除率达到90.4334%。

2.1.1.2 TCA法 TCA法是一种用三氯乙酸溶液调节多糖粗提液,使蛋白变性沉淀的一种有效脱蛋白方法,该法对酸度及沉淀时间要求比较高,否则容易使糖苷键断裂使多糖失活,影响蛋白脱除率及多糖得率[27]。张海燕[28]利用 TCA 法对山药多糖脱蛋白后,多糖保留率为24.19%,蛋白脱除率为95.03%,脱蛋白率较高。

2.1.1.3 酶法 酶法由于专属性强,普遍认为是常用的脱蛋白方法之一,通常选用专一性低的蛋白酶酶解蛋白质,释放多糖。酶法脱蛋白专一性强,脱蛋白次数减少、有机溶剂耗费少,除蛋白的效果更佳[3]。潘莹[29]对冬枣多糖酶法脱蛋白的正交实验结果确定最佳脱蛋白方法为酶-TCA法,其蛋白质脱除率为91.19%,多糖保留率为89.99%。

2.1.2 脱色 粗多糖中常含有一些色素,脱色可以改善多糖的外观,并有利于多糖的纯化,根据其性质不同采取不同的除色素方法。常见的脱色方法有离子交换法、氧化法、金属络合物法、吸附法。活性炭吸附法一般去除鞣质色素。DEAE纤维素吸附法是目前最常用的脱色方法,通过离子交换柱不仅达到脱色的目的,而且可以进行多糖的分离。双氧水脱色方法是直接氧化提取液中的色素,并未脱除,宜在低温下进行,否则会引起多糖的降解。

2.2 多糖进一步分离纯化

多糖进一步纯化方法主要有:分级沉淀法、柱层析法、膜分离法、透析法、亲和层析、电泳、大孔吸附树脂纯化等。

2.2.1 分级沉淀法 分级沉淀法可以分为有机溶剂法、盐析法和季铵盐沉淀法。有机溶剂分级沉淀法根据多糖在不同浓度的低级醇或酮中具有不同的溶解度的性质,逐次分步沉淀。这种方法适宜于分离各种溶解度相差较大的多糖。盐析法根据不同多糖在不同盐浓度中具有不同溶解度的性质,加入不同盐析剂使之逐步析出。季铵盐沉淀法根据长链季铵盐能与酸性多糖成盐,形成水不溶性多糖化合物的特性,常用此法分离酸性及中性多糖。

2.2.2 柱层析法 粗多糖是混合物,一般用柱层析法进行纯化,柱层析法可分为两类。离子交换柱层析法按电荷性质的不同,常用交换剂为 DEAE-纤维素、DEAE-Sephadex、CM-Sephadex、SE-Sephadex等,此法适合于分离各种酸性、中性及黏性多糖。凝胶过滤柱层析法是根据多糖分子的大小和形状不同而达到分离目的。常用的凝胶介质有交联葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶及聚丙烯酰胺凝胶等。白也明[30]应用DEAE-纤维素离子交换柱层析、凝胶过滤层析依次对刺五加多糖进行分级,获得目标纯多糖组分。Siriluck[31]、Li[32]、Shen[33]、Pu[34]等人利用离子柱层析法、葡聚糖凝胶柱层析对多糖进行纯化,纯化后多糖纯度显著提高。

2.2.3 膜分离法 膜分离是一种新兴的分离技术,在多糖领域中使用较多的是超滤技术。超滤膜能截留相对分子量从几千到几十万的多糖,选用不同截留量的超滤膜处理样品可以快速地得到分子量不同的多糖组分,在超滤的过程中还能同时起到浓缩和除盐的效果。醋酸纤维素膜是分离多糖最常用的一种膜。纵伟[35]通过超滤法对红枣多糖提取液进行纯化,得到最佳超滤条件为操作压力0.12 MPa、操作温度32 ℃、pH6.5,最佳条件下膜通量达到16.4 mL/(m2·s),该超滤工艺方法纯化红枣多糖简单可行,效率高。

2.2.4 其他 中国的天然资源丰富,活性多糖种类繁多、结构相对复杂、分离纯化难度较大等问题,对天然活性多糖的研究与应用带来了的挑战。在多糖纯化研究的操作中,往往需要结合不同的方法才能进行高效的分离纯化。因此,运用不同提取方法、分离纯化技术对各种活性多糖进行开发应用,是活性多糖研究工作的重点。

3 多糖的生物活性

多糖有重要的生物活性功能,在功能食品和临床药物上已得到广泛开发应用,同时多糖的研究一直是近几十年来的热点。从原材料中提取多糖,经分离纯化、组分分析、功能性研究发现,多糖具有抗氧化活性、免疫调节、抗肿瘤、降血糖、降血脂、抗炎、抗疲劳、抗衰老等生物活性功能。

3.1 免疫调节活性

研究表明,植物多糖可通过与免疫细胞表面的多种受体结合、激活不同的信号通路来调控动物机体的免疫系统[36]。植物多糖引起巨噬细胞活化是通过特异性受体来介导,也可通过内吞作用活化NF-κB,进而介导巨噬细胞的激活,发挥免疫调节作用[37]。如黑果枸杞叶多糖(LRLP3S)在蛋白和细胞水平上有降低细胞损伤的抗氧化活性,可显著刺激B、T淋巴细胞增殖,LRLP3作为一种潜在的免疫活性成分,对小鼠的细胞免疫功能具有促进作用[38]。

3.2 抗肿瘤活性

王宁[39]从杏鲍茹中提取分离纯化得到多糖组分,并对其结构进行了初步的检测与观察,筛选得到组分PEP-2,PEP-2将人肝癌细胞HepG 2的生长阻滞在s期,通过阻滞肝癌细胞的细胞周期及诱导细胞凋亡，发挥抗肿瘤活性;这一研究发现为多糖的抗肿瘤功能性食品因子或其药物的开发提供了理论依据。此外,还有当归多糖、人参多糖、茯苓多糖、黄芪多糖、香菇多糖、云芝多糖、五味子多糖、海洋真菌多糖、灵芝多糖、酵母多糖及地榆多糖等已经被证明具有明显的抗肿瘤作用。

3.3 降血糖活性

糖尿病(Introduction Diabetes Mellitus)是一种代谢紊乱和血糖水平异常升高的慢性病,主要由于胰岛素分泌不足或胰岛素作用器官效应降低[40]。研究人员指出,植物多糖通过增加肝糖原、促进外周组织器官对多糖的利用、促进降糖激素和抑制升糖激素作用等途径起到降血糖作用[41]。此外,茶叶、人参、灵芝、知母、薏苡仁、刺五加、米糠、枸杞等多糖提取物都有降血糖作用。

3.4 降血脂活性

张进松[42]等人将建模成功的小鼠随机均衡分为高脂模型组和海带多糖治疗组,结果表明海带多糖可以通过提高下丘脑OBR的水平,改善瘦素抵抗,从而发挥降脂作用。黄昊乐[43]研究黄芪多糖对高血脂大鼠肾皮质辅酯酶的影响,表明黄芪多糖具有明显的降脂抗氧化作用,能减少脂质过氧化产物,对高血脂大鼠具有一定的肾脏保护作用。此外龙胆多糖、南瓜多糖、玉米多糖、桑叶多糖、枸杞多糖等都有有明显的降血脂作用。

3.5 抗衰老

多糖抗衰老与其免疫调节剂调节机体免疫功能及增强机体对自由基的清除和抗氧化能力有关。黄赛金[44]等人经Morris水迷宫和小鼠跳台实验测试小鼠的学习记忆能力,实验结果表明,衰老小鼠的学习记忆能力增强,淡竹叶多糖具有显著的抗衰老作用。另外,当归、山茱萸等多糖也具有很好的抗衰老生物活性。

3.6 抗凝血

李德海[45]等人采用水、酸溶液及碱溶液提取黑木耳多糖,研究其抗凝血功能。结果表明,3 种黑木耳多糖均表现出显著抗凝血活性,最后结论得出经除蛋白处理的碱溶性黑木耳多糖可作为一种天然抗凝血活性成分进行更进一步的研究。研究人员通过对红枣、大蒜、龙胆等研究,其结果都证实了多糖的抗凝血作用。

3.7 抗炎症

具有抗炎作用的多糖主要是通过调节炎症细胞分泌的一种或多种炎症介质,平衡炎症部位的促炎因子与抗炎因子的水平,影响炎症发展过程的各个阶段[46]。相关研究表明,樟芝[47]、灰树花β-葡聚糖、茯苓多糖、金耳多糖均有炎症抑制作用。

多糖还具有抗疲劳、抗溃疡[48]、抗血管增生[49]、抗病毒、抗辐射、抗突变、抑菌等作用,随着研究的不断深入,越来越多的多糖及其药理活性将会显现出来。

4 结论

近几十年来,关于多糖的研究一直是国内外研究的热点与重点。目前,人们已在天然多糖的提取纯化、结构分析以及生物活性的研究上取得了丰硕的成果,天然多糖已经开始在食品,药物、功能性保健品以及化妆品等领域进行开发应用。但就目前天然多糖研究的层次和水平来说,还存在构效关系、功能机制、结构分析测定、多糖的合成以及工业化生产等方面的难题需要攻克。所以说,多糖研究的空间非常大,应用前景广阔,随着科研人员的不懈追求以及科学技术的逐步提高,相信多糖作为一类新型大分子物质,将在人类的生活、健康方面发挥更大的应用价值。

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Advances in bio-active polysaccharides

ZHANG Shu-jie,KANG Yu-fan*

(The Agricultural College of China Agricultural University,Beijing 100193,China)

Bio-active polysaccharides,connected with numerous the same or different monosaccharides by glycosidic bonds,are glycopolymers. Many common bioactivities of polysaccharides have been demonstrated in recent decades,such as immunomodulatory,antitumor,reducing glycemia,etc. The features of safety and non-toxicity in bioactive polysaccharides contribute to the broad application values and development prospects in fields of medicine,agriculture and food industry. Bioactive polysaccharide has been a hot spot in each scientific field both at home and abroad. This paper mainly aims to introduce the methods of extraction,purification,and the bioactivities of bioactive polysaccharides at home and abroad in recent 5 years.

bioactive polysaccharides;extraction;purification;bioactivities

2016-07-20

张淑杰(1989- )，女，硕士，研究方向：多糖功能特性，E-mail:1254420352@qq.com。

*通讯作者:康玉凡(1963-)，女，教授，研究方向：食用豆产品加工工程，E-mail:yfkang@cau.edu.cn。

现代农业产业技术体系-食用豆体系(CARS-09-06B)。

TS201.1

A

1002-0306(2017)02-0379-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.065