乙醇分级法分离南酸枣多糖及其理化性质和抗氧化性研究

李景恩,赵 颖,陈 卓

(江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌 330045)

乙醇分级法分离南酸枣多糖及其理化性质和抗氧化性研究

李景恩,赵 颖,陈 卓

(江西农业大学食品科学与工程学院,江西南昌 330045)

本文依次采用60%(v/v)和80%(v/v)的乙醇溶液对南酸枣粗多糖进行分级沉淀,分别获得两个组分CAP-60和CAP-80,上清液部分冷冻干燥后标记为CAP-S。采用分析化学法测得三个组分的中性糖、糖醛酸及蛋白质含量,并应用红外光谱仪分别检测各组分的光谱学特征。最后通过DPPH自由基和羟基自由基清除及还原力实验,检测南酸枣多糖各组分的抗氧化活性。结果表明CAP-60、CAP-80和CAP-S的总糖含量分别为94.95%±2.51%、71.50%±2.02%、35.18%±2.06%,且三个组分中均含有糖醛酸,与红外光谱图中1700～1600 cm-1附近的吸收峰一致。在上述三种抗氧化体系中,CAP-S均表现出最强的抗氧化能力,但在最高浓度下仍略次于抗坏血酸。

南酸枣多糖,乙醇分级法,理化性质,抗氧化性

南酸枣系漆树科南酸枣属植物,其果实又名五眼果、山枣、醋酸果等,主要分布于我国的湖北、湖南、广东、广西、福建、云南、浙江、贵州和江西等地。南酸枣鲜果为金黄色,呈椭圆形,其滋味酸中带甜,常被用作水果新鲜食用或加工成酸枣糕、饮料等食品,食之具有助消化、增食欲、治疗食滞腹痛、便秘等功效[1-2]。研究发现南酸枣果实、果皮和枣核中含有丰富的酚酸类、黄酮类、甾醇类、胸腺嘧啶脱氧尿苷类及脂肪族类等药用成分[3-6]。此外,赵玉英等[7]在其成熟的干燥果实(广枣)中提取到大量多糖成分(总含量约18.1%),其中水溶性多糖占9.8%,主要由阿拉伯糖、木糖、半乳糖和葡萄糖组成。然而,南酸枣鲜果中的多糖尚未见有关报道。

目前常见的多糖纯化方法主要有分级沉淀法(乙醇、中性盐等)、季铵盐沉淀法、柱层析法(离子交换柱、凝胶柱、亲和层析柱等)、超滤法等[8]。其中分级沉淀法由于具有操作简单,分离速度快等优点,而常被优先考虑。该方法根据不同分子量多糖在一定浓度的乙醇或中性盐溶液中具有不同的溶解度而进行分离[9]。因此本文首先利用传统的热水浸提法得到南酸枣鲜果中的粗多糖,然后采用乙醇分级沉淀法对其进行初步分离纯化,并测定所得各组分的中性糖、糖醛酸、蛋白质含量及其抗氧化活性。研究结果旨在帮助开发南酸枣鲜果中的多糖成分,为后续的结构鉴定及活性研究奠定前期基础,同时也为开发一种新型天然抗氧化制剂提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

新鲜南酸枣 采自江西省赣州市崇义县,洗净、去核、烘干、粉碎后备用;浓硫酸、磷酸、水杨酸、三氯乙酸、无水乙醇、丙酮、无水乙醚、30%双氧水、苯酚、氢氧化钠、硫酸亚铁、氯化铁、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、铁氰化钾 国药集团化学试剂有限公司;葡萄糖、牛血清蛋白(BSA)、四硼酸钠、m-羟基联苯、3-苯基苯酚、考马斯亮蓝G-250、抗坏血酸 阿拉丁试剂(上海)有限公司;DPPH、光谱纯溴化钾、半乳糖醛酸 美国Sigma公司。

V-5600型紫外分光光度计 上海元析仪器有限公司;METTLER-TOLEDO AL104型电子天平 瑞士梅特勒-托利多公司;Milli-Q型超纯水制备系统 美国Millipore公司;101A-2型电热鼓风干燥箱 上海实验仪器厂有限公司;HH-60型数显恒温搅拌循环水箱 常州国华仪器有限公司;SHZ-D(III)型循环水式真空泵 巩义市子华仪器有限责任公司;RE-52AA型旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;DZF-6090Z型真空干燥箱 上海跃进医疗器械有限公司;YP-2型压片机 上海山岳科学仪器有限公司;Nicolet iS5型傅立叶变换红外光谱仪 美国热电公司。

1.2 实验方法

1.2.1 南酸枣粗多糖的制备 称取20.0 g粉碎过的南酸枣干燥果实,加入800 mL蒸馏水,于100 ℃下提取5 h后过滤。将滤液浓缩至一定体积,然后加入3倍体积的无水乙醇,置于4 ℃冰箱过夜,再以4800 r/min的转速离心10 min,所得沉淀部分即为南酸枣粗多糖(CAP)。最后分别以无水乙醇、丙酮和无水乙醚各洗涤2次,冷冻干燥后备用。

1.2.2 乙醇分级法分离南酸枣粗多糖 精密称取3.0 g上述南酸枣粗多糖,以一定量的蒸馏水复溶,缓慢均匀地加入无水乙醇。当乙醇体积分数达到60%(v/v)时,溶液中出现大量沉淀,于4 ℃静置12 h后,再于4800 r/min下离心10 min,沉淀冷冻干燥后得组分CAP-60。继续向上清液中添加无水乙醇至体积分数为80%(v/v),第二次出现大量沉淀时,重复上述步骤,得组分CAP-80。剩余上清液部分浓缩、冷冻干燥后标记为CAP-S,分别计算各组分得率。

1.2.3 理化性质测定 以葡萄糖为标准品,苯酚-硫酸法测定中性糖含量[10];以半乳糖醛酸为标准品,间羟联苯法测定糖醛酸含量[11];以牛血清蛋白(BSA)为标准品,考马斯亮蓝法测定蛋白质含量[12]。所有样品重复测定3次,取其平均值。

1.2.4 红外光谱测定 分别称取1～2 mg干燥的多糖样品,按1∶200的比例混合加入光谱纯的KBr晶体,一起研磨成粉后压片,利用傅立叶变换红外光谱仪在400～4000 cm-1波数范围内进行扫描。

1.2.5 抗氧化活性研究 分别通过DPPH自由基(DPPH·)和羟基自由基(·OH)清除及还原力实验,检测南酸枣多糖各组分的抗氧化活性。

1.2.5.1 DPPH·清除率测定 取不同质量浓度的多糖溶液(78.1、156.2、312.5、625、1250、2500、5000 μg/mL)各2.0 mL于试管中,分别加入40 μg/mL新鲜配制的DPPH-乙醇溶液2.0 mL,避光反应30 min,于517 nm波长处测定吸光度(Ai)。再取上述多糖液2.0 mL,加入2.0 mL去离子水,放置30 min,于517 nm处测定吸光度(Aj),作为样品的本底吸收。取2.0 mL DPPH-乙醇溶液,加入2.0 mL 无水乙醇,放置30 min后测定吸光度(A0),作为空白对照。每个浓度的样品重复测定3次取平均值。以抗坏血酸作为阳性对照,DPPH·的清除率计算公式为:

式(1)

1.2.5.2 ·OH清除率测定 反应体系中依次加入6 mmol/L FeSO41 mL,6 mmol/L水杨酸-乙醇1 mL,以及不同浓度的南酸枣多糖1 mL(78.1、156.2、312.5、625、1250、2500、5000 μg/mL)。最后加入1 mL 6 mmol/L H2O2启动反应,于37 ℃反应1 h。以蒸馏水代替多糖样品作空白对照,抗坏血酸作阳性对照,于510 nm下测定各样品的吸光度。每组样品均以1 mL蒸馏水代替1 mL 6 mmol/L水杨酸-乙醇作为样品的本底吸收。·OH清除率的计算公式为:

式(2)

其中，A0为空白对照的吸光度,A1为加入多糖或阳性对照的吸光度,A2为不加水杨酸-乙醇的样品本底吸收。

1.2.5.3 还原力测定 根据Chen Jingjing等的测定方法[13],取2 mL不同浓度的多糖样品(78.1、156.2、312.5、625、1250、2500、5000 μg/mL),分别与2.0 mL PBS缓冲液(0.2 mol/L,pH6.6)和2.0 mL铁氰化钾溶液[K3Fe(CN)6](1%,w/v)混合均匀,然后于50 ℃水浴中保温20 min。向反应液中加入2.5 mL三氯乙酸(10%,w/v)终止反应,然后于3000 r/min离心10 min。取2.0 mL上清液与2.0 mL蒸馏水和1.0 mL FeCl3(0.1%,w/v)混匀,静置10 min,然后于700 nm测定吸光度,以相同浓度的抗坏血酸作阳性对照。

1.3 数据处理

2 结果与分析

2.1 理化性质分析

表1 不同浓度乙醇制备南酸枣多糖的得率和化学组成分析Table 1 The yields and chemical composition of Choerospondias axillarispolysaccharides precipitated by different concentrations of ethanol

注:a指粗多糖CAP的质量占南酸枣原材料干重的百分比;b指乙醇分级沉淀所得各组分的质量占溶解时所使用粗多糖干重的百分比。

水提醇沉法制备的南酸枣粗多糖经不同浓度的乙醇分级沉淀后得到三个新的组分CAP-60、CAP-80和CAP-S,其得率和化学组成分析见表1。由表1可知,粗多糖CAP的总糖含量为84.48%±0.39%,CAP-60的总糖含量最高(94.95%±2.51%),得率也最高(61.02%),说明该段提取物为粗多糖的主要组分。3个组分中都检测到蛋白质和糖醛酸,说明它们都属于酸性糖蛋白复合物。

2.2 红外光谱分析

ACP-60、ACP-80和ACP-S的红外光谱见图1。由于多糖结构具有一定相似性,因此它们的红外光谱图也具有某些相似的特征吸收峰。图1中,3种多糖在3600～3200 cm-1附近均具有较宽的吸收峰,即多糖的O-H伸缩振动,而3000～2800 cm-1处的小肩峰为C-H(CH,CH2和-CH3)的伸缩振动[14]。

图1 CAP-60、CAP-80和CAP-S的红外光谱图Fig.1 IR spectra of CAP-60,CAP-80 and CAP-S

3种多糖在1700～1600 cm-1附近均有明显的吸收峰,为-COOH中C=O的不对称伸缩振动,说明多糖结构中含有糖醛酸,与表1结果一致。其中1630 cm-1处的强吸收峰代表游离羧基中C=O的伸缩振动,而1740 cm-1处的吸收峰则代表羧基被酯化后C=O的伸缩振动,二者面积之比可用于计算果胶类多糖的酯化度[15-16]。

1000 cm-1附近的吸收峰是由吡喃糖环C-O-C结构中两种C-O键的伸缩振动引起的[17]。1000～800 cm-1间有许多弱小吸收峰,证明β-D-吡喃葡萄糖环的存在[18]。

2.3 抗氧化活性研究

2.3.1 DPPH·清除率 如图2所示,3种多糖对DPPH·均具有一定的清除能力,且随多糖浓度的增加,各组分对DPPH·的清除率也逐渐增加。当浓度为1250 μg/mL时,CAP-S对DPPH·的清除率为90.3%,CAP-60和CAP-80的清除率分别为23.7%和11.5%,说明南酸枣多糖对DPPH·具有较好的清除能力,且分子量小的组分比分子量大的清除效果更好。由图2可见,浓度在78.1～1250 μg/mL范围时,CAP-S对DPPH·的清除率随浓度增加而明显上升;浓度大于1250 μg/mL时,其清除率趋于平缓。计算可得各样品的IC50值分别为CAP-S(373 μg/mL)

图2 南酸枣多糖对DPPH·的清除率Fig.2 DPPH· scavenging rate of Choerospondias axillaries polysaccharides

2.3.2 ·OH清除率 图3为3种南酸枣多糖组分对·OH清除率的影响。随多糖浓度的增加,3种多糖对·OH的清除率均呈现一定的量效关系,其中CAP-S的清除作用最强。5000 μg/mL浓度下,CAP-S对·OH的清除率为84.0%,与马齿苋多糖、榆耳菌丝体多糖相似[20-21]。该浓度下,CAP-60和CAP-80的清除率只有13.19%和19.14%。计算CAP-S的IC50值为1888 μg/mL,略高于百合多糖(IC50=1040 μg/mL)[22],而远远低于黄连多糖(IC50>3880 μg/mL)[23]。本实验中抗坏血酸的IC50值为485 μg/mL,说明CAP-S对·OH的半清除率远远不及阳性对照组。

图3 南酸枣多糖对·OH的清除率Fig.3 Hydroxyl radical(·OH)scavenging rate of Choerospondias axillaries polysaccharides

图4 南酸枣多糖的还原力测定Fig.4 The reducing power of Choerospondias axillaries polysaccharides

2.3.3 还原力 还原力是评价多糖抗氧化性的另一项重要指标,与多糖的抗氧化能力直接相关[24]。吸光度越大,代表样品的还原力越大。由图4可知,抗坏血酸、CAP-60、CAP-80和CAP-S对Fe3+均具有一定的还原能力,强弱顺序为抗坏血酸>CAP-S>CAP-60>CAP-80,其中CAP-60和CAP-80无显著性差异。2500 μg/mL浓度下CAP-S吸光值达到1.733,还原力为抗坏血酸的57.8%,计算此时CAP-60和CAP-80的还原力仅为抗坏血酸的11.7%和11.0%。通过与文献对比发现,南酸枣多糖CAP-S的还原力明显高于大蒜多糖[25]、槐花多糖[26]、红参多糖[27]等。

3 结论

本文采用不同浓度的乙醇从南酸枣粗多糖中依次沉淀出3个新组分CAP-60、CAP-80和CAP-S,并初步分析它们的基本化学组成、红外光谱性质及抗氧化活性。结果表明3种多糖结构中均含有糖醛酸和少量蛋白质,说明它们都属于酸性糖蛋白复合物,其中CAP-60的糖醛酸含量高达70.373%±0.836%。红外光谱显示,CAP-60、CAP-80和CAP-S在3600～3200 cm-1和3000～2800 cm-1区域内都出现糖类物质典型的特征吸收峰,且在1700～1600 cm-1附近具有明显的糖醛酸吸收峰。抗氧化实验结果表明,各多糖组分清除DPPH·和·OH的能力及对Fe3+的还原力都随多糖浓度升高而增加,呈现一定的正相关。3种体外抗氧化体系中,CAP-S的抗氧化能力明显高于CAP-60和CAP-80。其清除DPPH·及·OH的IC50值分别为373 μg/mL和1888 μg/mL,可见CAP-S清除DPPH·的能力要远远高于清除·OH的能力,而其在最高浓度下对还原Fe3+的能力与抗坏血酸相同。

综上,本研究不仅确定了南酸枣鲜果中多糖的基本化学组成,同时也验证了其体外抗氧化能力,从而为后续研究其抗氧化机理,其他生物学活性,结构与功能的相关性等内容奠定了基础。

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Physicochemical properties and antioxidant activities of polysaccharides isolated fromChoerospondiasaxillarisby ethanol fractional precipitation method

LI Jing-en,ZHAO Ying,CHEN Zhuo

(College of Food Science and Engineering,Jiangxi Agricultural University,Nanchang 330045,China)

Two new polysaccharides(CAP-60 and CAP-80)were fractionated from the crude polysaccharides ofChoerospondiasaxillarisby 60%(v/v)and 80%(v/v)ethanol,successively. A third fraction CAP-S was obtained from the supernatant by freeze drying. Neutral sugar,uronic acid and protein contents were determined by analytical chemistry methods,and their spectral characteristics were determined by FTIR spectrometer. DPPH free radical and hydroxyl radical scavenging test,as well as reducing power were applied to evaluate the antioxidant activities of these three fractions. The results indicated that the total sugar of CAP-60,CAP-80 and CAP-S were 94.95%±2.51%,71.50%±2.02% and 35.18%±2.06%,respectively. They all contained uronic acids in their structures,which were consistent with the absorption peaks of 1700～1600 cm-1in the infrared spectrum. What’s more,CAP-S possessed the strongest antioxidant activities among these three antioxidant systems above,but was still inferior to ascorbic acid even under the highest concentration.

Choerospondiasaxillariespolysaccharides;ethanol fractional precipitation;physicochemical properties;antioxidant activities

2016-06-17

李景恩(1984-)，女，博士，讲师，研究方向：天然多糖的分离提取、结构鉴定及活性研究，E-mail：enen928@163.com。

江西省教育厅科学技术研究项目(GJJ150433)；江西农业大学博士启动费(9232305199)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)02-0132-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.016