蘘荷水溶性多糖的理化性质及其体外抗氧化活性

2017-03-08 10:57朱培蕾汪名春赵士伟赵贵云刘才宇
食品工业科技 2017年2期
关键词:单糖螯合半乳糖

朱培蕾,汪名春,赵士伟,赵贵云,刘才宇,*

(1.安徽省农业科学院园艺研究所,安徽合肥 230031; 2.安徽农业大学茶与食品科技学院食品科学与工程系,安徽合肥 230036)

蘘荷水溶性多糖的理化性质及其体外抗氧化活性

朱培蕾1,2,汪名春2,赵士伟2,赵贵云1,刘才宇1,*

(1.安徽省农业科学院园艺研究所,安徽合肥 230031; 2.安徽农业大学茶与食品科技学院食品科学与工程系,安徽合肥 230036)

以蘘荷花轴为原料,通过水提醇沉法提取制备蘘荷水溶性多糖(water-soluble polysaccharides fromZingibermiogaRosc.,ZMPs-W),采用化学和仪器分析方法研究了多糖的总糖含量、单糖组成、官能团特征、空间构像等理化性质,并通过体外抗氧化实验探讨了蘘荷水溶性多糖的抗氧化活性。研究结果表明:ZMPs-W是以半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、葡糖糖醛酸、阿拉伯糖、木糖和鼠李糖(各组分之间的摩尔百分比为:33.12∶18.79∶15.93∶11.47∶9.81∶5.98∶5.90)为主要组成成分的,含有羧基、硫酸基和吡喃环的多糖类物质,且具有三螺旋结构。其总糖含量和蛋白质含量分别为73.76%和0.35%;体外抗氧化实验表明:ZMPs-W具有一定的抗氧化活性,在本实验条件下,其清除羟基自由基、DPPH自由基以及螯合金属离子的能力随着添加剂量的增加而增强,其中清除羟基自由基和DPPH自由基的能力表现突出。

蘘荷,多糖,理化性质,抗氧化活性

蘘荷,别称阳荷、茗荷、野姜等,系多年生姜科草本植物,序状花轴是蘘荷的主要食用部分,因具有色鲜、质脆、风味独特等特点,深受广大消费者喜爱。蘘荷营养丰富,每100 g嫩茎和花轴含蛋白质约12.4 g、脂肪2.2 g、纤维素28.1 g、维生素C和维生素A共约95.8 mg,并富含钙、铁、锌等多种微量元素[1]。另外,据《唐本草》、《本草图经》、《四川中药志》等药典记载,蘘荷花轴、根茎和种子皆可入药,具有活血调经、镇咳祛痰、消肿解毒等功效,是中成药的宝贵原料[2]。自上世纪80年代起,国内外学者围绕蘘荷资源的开发利用,开展了生物学特性[3-5]、栽培技术[6-7]、贮藏加工[8-9]、色素提取[10-11]、化学成分分析[12]等一系列研究工作。在蘘荷功能特性研究方面,日本学者Kim Ha Won[13]等考察了89种可食用植物的氯仿抽提物对超氧阴离子的抑制作用,研究结果表明蘘荷抑制活性最强;并发现蘘荷能够抑制巨噬细胞中诱导型促炎基因的表达。这意味着蘘荷具有很强的抗氧化能力和抗炎潜力,在预防和治疗慢性炎症以及与之相关的癌症方面将具有广阔的应用前景。

本研究通过水提醇沉法,从蘘荷花轴中提取制备蘘荷水溶性多糖(water-soluble polysaccharides fromZingibermiogaRosc.,ZMPs-W),利用化学和仪器分析方法对ZMPs-W的总糖含量、蛋白质含量、单糖组成、官能团特征和空间构像等进行分析研究,并通过体外抗氧化实验探讨了ZMPs-W的抗氧化活性。研究结果将为进一步开发利用蘘荷这一宝贵资源提供理论基础和科研依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

蘘荷 2014年8月购于安徽省岳西县;牛血清白蛋白标准品、1,1-二苯基苦基苯肼(DPPH)、甘露糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖等单糖标准品 美国Sigma-Aldrich公司产品;甲醇、1-苯基-3-甲基-5-吡唑(PMP)、乙腈、苯酚、硫酸、95%乙醇、氯仿、三氟乙酸、考马斯亮蓝G-250、磷酸、菲洛嗪、水杨酸、氯化亚铁、双氧水等 市售分析纯;工业乙醇(95%) 市售。

V-1600型紫外可见分光光度计 上海美普达仪器有限公司;HH数显恒温水浴锅 金坛市金城国胜实验仪器厂;GZX-9070MBE数显鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;Waters 1525 Binary型液相色谱仪 美国Waters公司。

1.2 实验方法

1.2.1 样品制备

1.2.1.1 蘘荷花轴预处理 新鲜蘘荷花轴清洗、切碎,于60 ℃条件下烘干后粉碎。按10∶1料液比,用体积分数75%酒精在70 ℃条件下回流提取2次,每次1.5 h。提取结束后,离心得到的料渣于60 ℃条件下烘干。最后,将得到的蘘荷粉末置于干燥器中备用[14-15]。

1.2.1.2 ZMPs-W的提取制备 称取一定量的蘘荷粉末,在料液比1∶30,提取温度100 ℃,提取时间4 h的条件下提取多糖。浸提液离心(4800 r/min,15 min)后留取上清液,沉淀物再用相同方法反复提取、离心3次。合并所有上清液,于50 ℃条件下旋转蒸发,浓缩至原体积的1/8。浓缩液中加入3倍体积工业乙醇(乙醇终体积分数为75%)沉淀多糖,冰箱放置过夜,离心后取沉淀物,加水溶解,旋转蒸发去除残留酒精后冷冻干燥,即得到ZMPs-W[14-15]。

1.2.2 ZMPs-W理化性质分析

1.2.2.1 总糖含量测定 采用苯酚硫酸法[14]制作葡萄糖标准曲线,并测定样品中的总糖含量。

1.2.2.2 蛋白质含量测定 采用考马斯亮蓝法[16]制作牛血清蛋白标准曲线,并测定样品中的蛋白质含量。

1.2.2.3 单糖组成分析 液相色谱条件[14]:色谱柱,ZORBAX Eclipse XDB-C18(Analytical 4.6 mm×250 mm,5-Micron);流动相,0.1 mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.8)-乙腈(体积比为83∶17);柱温,30 ℃;流速,1 mL/min;进样量,25 μL。

单糖标准品衍生化和标准曲线制作[14]:精确称取10 mg各单糖标准品,加入2 mL蒸馏水,配成5 mg/mL单糖标准溶液。取标准品溶液100 μL,加入100 μL 0.6 mol/L NaOH溶液,混合均匀。取100 μL混合液置于1.5 mL离心管中,向其中加入100 μL 0.5 mol/L的PMP甲醇溶液,漩涡混匀后在70 ℃下水浴100 min,待衍生化结束后,冷却至室温。向混合液中加入100 μL 0.3 mol/L的HCl以中和反应液。反应混合物在55 ℃旋转蒸发至干,再向其中加入氯仿和蒸馏水各1 mL,摇匀静置,弃氯仿层,重复进行3次萃取操作。萃取结束后,样品用0.45 μm微孔滤膜过滤后做梯度稀释,各浓度梯度样品进HPLC分析,绘出单糖标准品峰面积对浓度的标准曲线。

ZMPs-W的酸水解和衍生化[14]:精确称取10 mg蘘荷多糖,配制成5 mg/mL样品溶液。取100 μL样液于水解管中,加入100 μL 4 mol/L的三氟乙酸,放入干燥箱,在120 ℃下水解2 h。水解结束后,向其中加入甲醇200 μL,50 ℃下旋转蒸发至干,重复3次。然后加入100 μL蒸馏水,按单糖标准品衍生化的方法进行样品衍生化。

根据标准品在液相色谱图上的出峰时间确定样品的单糖组成,根据标准曲线计算样品中各单糖组成的摩尔百分比。

1.2.2.4 紫外光谱扫描 称取多糖样品,用蒸馏水配成0.5 mg/mL的溶液,采用V-1600型紫外可见分光光度计进行扫描,扫描波长200~400 nm。

1.2.2.5 红外光谱扫描 采用KBr压片法[17],对多糖样品进行红外光谱测定,扫描范围为4000~500 cm-1。

1.2.2.6 空间构象分析 采用刚果红实验[17]分析多糖样品的空间构象。称取多糖样品5~10 mg,加蒸馏水2 mL、80 μmol/L的刚果红试剂2 mL,混匀。逐渐加入1 mol/L 的NaOH溶液,使溶液的NaOH终浓度分别为0、0.1、0.2、0.3、0.4和0.5 mol/L,于200~800 nm间进行紫外-可见光谱扫描,测量不同NaOH浓度下溶液的最大吸收波长。另一反应体系,不加多糖样品,加同样的蒸馏水、刚果红试剂和NaOH溶液,以相同方法测量不同NaOH浓度下溶液的最大吸收波长。比较反应体系的最大吸收波长变化情况。

1.2.3 ZMPs-W抗氧化活性分析

1.2.3.1 羟基自由基(·OH)清除能力 ·OH清除能力的测定参照参考文献[18]报道的方法稍作修改。取不同浓度(0~4 mg/mL)的多糖溶液1 mL于试管中,然后每个试管依次加入1 mL 9 mmol/L的FeSO4溶液、0.5 mL 9.0 mmol/L的水杨酸溶液(无水乙醇配制)和1 mL 0.3% H2O2溶液,混合均匀后于37 ℃水浴30 min,于分光光度计510 nm处测定吸光度值,并用乙醇调零。以VC作阳性对照,以相同方法测定其清除·OH能力。ZMPs-W清除·OH的能力依下面公式计算:

式中:A0,空白组吸光度值(乙醇代替样品);A1,样品吸光度值;A2,样品干扰实验吸光度值(水杨酸溶液代替FeSO4溶液和H2O2溶液)。

1.2.3.2 DPPH自由基(DPPH·)清除能力 DPPH·清除能力的测定参照参考文献[19]报道的方法稍作修改。取不同浓度(0~4 mg/mL)的多糖溶液2 mL于试管中,加入2 mL的DPPH溶液(0.1 mmol/L,要求现配现用),混合均匀,并在避光条件下室温放置30 min。于分光光度计517 nm处测定吸光度值,用蒸馏水调零。以VC作阳性对照,以相同方法测定其清除DPPH·能力。ZMPs-W清除DPPH·的能力依下面公式计算:

式中:A0,空白组吸光度值(蒸馏水代替样品);A1,样品吸光度值;A2,样品干扰实验的吸光度值(甲醇代替DPPH)。

1.2.3.3 金属离子螯合能力 金属离子螯合能力的测定参照参考文献[20]报道的方法稍作修改。取不同浓度(0~4 mg/mL)的多糖溶液1.0 mL于试管中,加入0.05 mL的FeCl2溶液(2 mmol/L)、2.75 mL蒸馏水和0.2 mL菲洛嗪溶液(5 mmol/L),混匀后室温放置10 min,于分光光度计562 nm处测定吸光度值,用蒸馏水调零。以EDTA-2Na作阳性对照,以相同方法测定其金属离子螯合能力。ZMPs-W螯合金属离子的能力依下面公式计算:

式中:A0,空白组吸光度值(蒸馏水代替样品);A1,样品吸光度值;A2,样品干扰实验吸光度值(蒸馏水代替FeCl2溶液)。

1.2.4 数据处理与分析 采用SPSS 17.0统计分析软件对实验数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 ZMPs-W理化性质

2.1.1 总糖含量 以葡萄糖为标准品,利用苯酚-硫酸法测定吸光度值,制作总糖含量标准曲线。得到葡萄糖微克数X与吸光值Y之间线性方程Y=0.0029X-0.0319,相关系数R2=0.9673,由此计算出制备的ZMPs-W总糖含量为73.76%。

2.1.2 蛋白质含量 以牛血清白蛋白为标准品,利用考马斯亮蓝法测定吸光度值,制作蛋白质含量标准曲线,得到蛋白质微克数X与吸光值Y之间的线性方程Y=0.0045X+0.2052,相关系数R2=0.9987,由此计算出ZMPs-W中的蛋白质含量为0.35%。

2.1.3 单糖组成 单糖标准品经过衍生化后通过HPLC检测,得到液相色谱图如图1所示。图1中1~10号色谱峰依次为甘露糖、核糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖和岩藻糖。

图1 单糖标准品液相色谱图Fig.1 HPLC chromatogram of standard monosaccharide注:1:甘露糖;2:核糖;3:鼠李糖;4:葡萄糖醛酸;5:半乳糖醛酸;6:葡萄糖;7:半乳糖;8:木糖;9:阿拉伯糖;10:岩藻糖。

ZMPs-W经过酸水解和衍生化后通过HPLC检测,得到的液相色谱图如图2所示。对比单糖标准品色谱峰保留时间可以看出,ZMPs-W主要含有半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、葡糖糖醛酸、阿拉伯糖、木糖和鼠李糖等单糖组分。各组分之间的摩尔百分比为:33.12∶18.79∶15.93∶11.47∶9.81∶5.98∶5.90。

图2 ZMPs-W单糖组成液相色谱图Fig.2 HPLC chromatogram of monosaccharidecomposition of ZMPs-W注:3:鼠李糖;4:葡萄糖醛酸;5:半乳糖醛酸;6:葡萄糖;7:半乳糖;8:木糖;9:阿拉伯糖。

2.1.4 紫外扫描 ZMPs-W紫外光谱图如图3所示。从图3中可以看出:ZMPs-W在240~290 nm处存在较微弱吸收峰,说明蛋白质含量较低。该结果与2.1.2化学方法检测结果一致。

图3 ZMPs-W紫外光谱图Fig.3 UV spectrum of ZMPs-W

2.1.5 红外扫描 ZMPs-W的红外光谱图如图4所示。图4中3400 cm-1左右处出现的宽而强的吸收峰由羟基的O-H伸缩振动引起,3000~2800 cm-1左右出现的两个吸收峰应该是由甲基或亚甲基的C-H伸缩振动引起,1330 cm-1处的吸收峰由C-H变角振动引起。O-H和C-H均为多糖类物质的特征基团,因此根据以上特征峰可以证明W-ZMPS为多糖类物质。1640 cm-1处和1410 cm-1处的吸收峰分别由羧基的C=O对称和非对称伸缩振动引起[21],由此可以说明ZMPs-W具有羧基基团。此外,在1240 cm-1处出现的吸收峰由硫酸基的S=O伸缩振动引起,据此可以判断,ZMPs-W中含有硫酸基团。1200~1000 cm-1左右的一组吸收峰由吡喃糖环的醚键C-O-C以及羟基的-OH变角振动引起[22-23]。上述分析表明ZMPs-W是一种酸性杂多糖,并含有吡喃环。

图4 ZMPs-W红外扫描图谱Fig.4 Infrared spectra of ZMPs-W

2.1.6 空间构象 刚果红可与具有三股螺旋结构的多糖形成络合物。在低浓度NaOH溶液中,三股螺旋结构与刚果红试剂形成的络合物,使溶液的最大吸收波长增加;高浓度时,三股螺旋被解开,不能形成络合物,溶液的最大吸收波长开始下降。因此,可根据NaOH浓度由低到高增加时,溶液最大吸收波长的变化情况,判断多糖样品是否具有三股螺旋结构。

在不同NaOH浓度时,刚果红试剂的最大吸收波长以及ZMPs-W与刚果红作用后溶液的最大吸收波长变化情况如图5所示。由图5可知,刚果红试剂的最大吸收波长随着NaOH浓度的增加而减少,未发生特征性变化。而ZMPs-W与刚果红作用后溶液的最大吸收波长发生了特征性变化,当NaOH浓度为0~0.3 mol/L时,体系的紫外吸收波长移向长波,NaOH浓度继续增加时,最大吸收波长开始下降,由此可以判断ZMPs-W能够与刚果红形成络合物,具有三股螺旋结构。

图5 不同NaOH浓度时刚果红试剂与ZMPs-W作用后最大吸收波长变化情况Fig.5 Changes in maximum absorption wavelength of mixture of Congo red and ZMPs-W at various concentration of NaOH

2.2 ZMPs-W体外抗氧化活性

2.2.1 羟基自由基清除能力 以VC为阳性对照,考察ZMPs-W清除·OH的能力,结果见图6。由图6可知,当溶液浓度为0~4 mg/mL时,ZMPs-W与阳性对照VC清除·OH的能力均随着溶液浓度的增加而增大,且浓度在0.1~0.5 mg/mL时,ZMPs-W的清除能力优于VC,随后清除能力增幅明显低于VC。当浓度为2 mg/mL时,VC的清除率达到97.94%,随后趋于平缓,而ZMPs-W的清除率仅为36.46%,差异显著。当溶液浓度为4 mg/mL时,VC的清除率达到99.5%,而ZMPs-W的清除率为64.66%。

图6 ZMPs-W羟基自由基清除能力Fig.6 The·OH scavenging activities of ZMPs-W

2.2.2 DPPH自由基清除能力 以VC为阳性对照,考察ZMPs-W清除DPPH·的能力,结果见图7。由图7可知,阳性对照VC清除DPPH·的效果显著,当浓度为0.1 mg/mL时,其DPPH·清除率即可达到95.81%,而此时ZMPs-W的清除率仅为11.31%。随着溶液浓度的增加,ZMPs-W的清除能力不断增强,而VC的清除能力相对平缓,当ZMPs-W溶液浓度达到4 mg/mL时,其清除率达到91.33%,与VC接近。

图7 ZMPs-W DPPH自由基清除能力Fig.7 The DPPH·scavenging activities of ZMPs-W

2.2.3 金属离子螯合能力 以EDTA-2Na为阳性对照,考察ZMPs-W螯合Fe2+的能力,结果如图8所示。由图8可知,当溶液浓度为0~4 mg/mL时,Fe2+能够被ZMPs-W以剂量依赖方式所螯合。溶液浓度为4 mg/mL时,ZMPs-W螯合Fe2+的能力为50.42%,相当于阳性对照EDTA-2Na螯合能力的一半。

图8 ZMPs-W螯合金属离子能力Fig.8 The Fe2+ chelating activities of ZMPs-W

3 结论

以蘘荷花轴为原料,通过水提醇沉法制备了蘘荷水溶性多糖ZMPs-W。分析结果表明ZMPs-W是含有吡喃环的酸性杂多糖,并具有三螺旋结构。其总糖含量为73.76%,蛋白质含量为0.35%。单糖组成主要为半乳糖、葡萄糖、半乳糖醛酸、葡糖糖醛酸、阿拉伯糖、木糖和鼠李糖,各组分之间的摩尔百分比为:33.12∶18.79∶15.93∶11.47∶9.81∶5.98∶5.90。体外抗氧化实验表明,ZMPs-W具有一定的抗氧化活性。当溶液浓度为0~4 mg/mL时,ZMPs-W清除羟基自由基、DPPH自由基,以及螯合金属离子的能力随着添加剂量的增加而增强,其中清除羟基自由基和DPPH自由基的能力表现突出。

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Physicochemical characteristic and antioxidation activityinvitroof water soluble polysaccharides fromZingibermiogaRosc

ZHU Pei-lei1,2,WANG Ming-chun2,ZHAO Shi-wei2,ZHAO Gui-yun1,LIU Cai-yu1,*

(1.Institute of Horticulture,Academy of Anhui Agricultural Science,Hefei 230031,China;2.Department of Food Science and Engineering,College of Tea and Food technology,Anhui Agricultural University,Hefei 230036,China)

Water-soluble polysaccharides(ZMPs-W),extracted from floral axis ofZingibermiogaRosc. by water extracting-alcohol precipitation method were studied by the means of chemical and apparatus analysis. The antioxidation activitiesinvitrowere also studied in this paper. The results showed that ZMPs-W were mainly constituted by galactose,glucose,galacturonic acid,glucuronic acid,arabinose,xylose,rhamnose(the mol ratio was 33.12∶18.79∶15.93∶11.47∶9.81∶5.98∶5.90). Triple helix structure,carboxyl group,sulfate group and pyran ring were found in the polysaccharides. The total sugar and protein content was 73.76% and 0.35%,respectively. Antioxidant experimentinvitrosuggested that ZMPs-W had antioxidant activities. Under the experimental conditions,the antioxidant activities(·OH clearance,DPPH· clearance and Fe2+chelation)increased with the increasing concentration. Especially,the clearance ablities of ·OH and DPPH· clearance were outstanding.

ZingibermiogaRosc.;polysaccharides;physicochemical property;antioxidation activity

2016-07-20

朱培蕾(1981-),女,博士研究生,助理研究员,研究方向:园艺产品贮藏与加工,E-mail:wz.1107@aliyun.com。

*通讯作者:刘才宇(1964-),男,副研究员,主要从事园艺产品采后处理与安全标准化生产方面的研究,E-mail:caiyu058@163.com。

安徽省农业科学院院长青年创新基金(14B0325)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)02-0136-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.017

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