荧光光谱法研究咖啡酸与胰脂肪酶相互作用

范金波,王晓露,姜海静,周素珍

(1.渤海大学食品科学与工程学院,辽宁省食品安全重点实验室,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013;2.唐山市丰润区综合职业技术教育中心,河北唐山 064000)

荧光光谱法研究咖啡酸与胰脂肪酶相互作用

范金波1,王晓露1,姜海静2,周素珍1

(1.渤海大学食品科学与工程学院,辽宁省食品安全重点实验室,生鲜农产品贮藏加工及安全控制技术国家地方联合工程研究中心,辽宁锦州 121013;2.唐山市丰润区综合职业技术教育中心,河北唐山 064000)

采用荧光光谱法研究了咖啡酸与胰脂肪酶的相互作用,主要包括荧光猝灭特性及结合常数、结合位点数的计算,抑制酶类型及抑制活性,金属离子对相互作用的影响。结果表明:咖啡酸加入后胰脂肪酶产生了规律性的荧光猝灭,最大吸收波长出现红移现象,主要属于静态猝灭。25 ℃和37 ℃下结合常数分别为6.48×104L/mol和1.38×105L/mol,热力学参数ΔH>0且ΔS>0,表明结合反应是自发进行的吸热反应,相互作用主要表现为疏水作用力。咖啡酸对胰脂肪酶的抑制类型为非竞争性抑制,抑制活性IC50为(0.88±0.07)mg/mL。四种金属离子(Cu2+、Ca2+、Fe3+、Fe2+)一定程度上增加结合常数和结合位点数,说明四种金属离子促进了咖啡酸与胰脂肪酶的结合。

胰脂肪酶,咖啡酸,荧光猝灭,金属离子,抑制活性

肥胖被认为主要是一种脂肪代谢紊乱疾病,肥胖的盛行已经危害到人们的健康,研究表明肥胖是导致心血管疾病、癌症和糖尿病的关键因素[1-4]。抗肥胖药物的研发主要集中于对脂肪代谢过程酶选择性控制,有效抑制胰脂肪酶活性可以起到减肥作用。研究报道茶多酚、苹果多酚、浆果来源多酚都具有较强的抑制胰脂肪酶活性,通过控制脂肪代谢起到减肥作用[5-7]。咖啡酸是常见的酚酸类物质,在植物中广泛存在,通过动物实验研究其调节脂肪代谢抗肥胖作用已有报道[8-9],探讨植物来源的多酚成分与胰脂肪酶的相互作用机理,对于了解减肥机制和多酚成分的应用具有重要意义。

荧光光谱法已经广泛用于小分子与蛋白质相互作用的研究,其中关于咖啡酸与蛋白质相互作用的报道较少。龙梅等[10]研究了咖啡酸及其衍生物与溶菌酶的相互作用,结果表明咖啡酸与溶菌酶的结合对其内源荧光产生静态猝灭,咖啡酸中的羧基对结合位点数起主要作用。余丹丹等[11]研究表明咖啡酸使乳蛋白发生内源性荧光猝灭,与蛋白结合导致咖啡酸抗氧化活性显著降低。柳全文等[12]研究报道咖啡酸与牛血清白蛋白有强的结合,结合通过影响色氨酸的微环境影响了牛血清白蛋白的构象。通过荧光光谱法研究咖啡酸与胰脂肪酶相互作用鲜见报道,本文主要以具有良好抗氧化活性的酚酸化合物咖啡酸为研究对象,通过荧光光谱法探索其与胰脂肪酶相互作用及作用机理,为小分子植物性胰脂肪酶抑制剂的开发利用提供一定的参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

F-7000荧光分光光度计 日本日立高新技术公司;KQ-500DE数控超声清洗仪 昆山市超声仪器有限公司;KJ-5A多头磁力搅拌器 金坛市科析仪器有限公司;HH-6数显电子恒温水浴锅 常州国华电器有限公司;ML104/02电子天平 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;FE20实验室PH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司;TDL-5-A低速大容量离心机 上海安亭科学仪器厂;UV-2700紫外-可见光分光光度计 日本SHIMADZU公司。

1.2 实验方法

1.2.1 咖啡酸与胰脂肪酶相互作用的荧光分析

1.2.1.1 荧光光谱的测定 准确移取0.30 mL咖啡酸溶液(0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液调pH7.7)与3 mL质量浓度为0.5 mg/mL的胰脂肪酶(0.05 mol/L的Tris-HCl缓冲液调pH7.7)溶液于1 cm的荧光比色皿中并将其混匀,使咖啡酸最终浓度达到0、9.09×10-6、1.8182×10-5、2.7273×10-5、3.6364×10-5、4.5455×10-5、5.4545×10-5、6.3636×10-5、7.2727×10-5、8.1818×10-5、9.0909×10-5mol/L,在25 ℃和37 ℃的条件下静置5 min后,放入荧光分光光度计于激发波长为290 nm,狭缝均为5 nm,发射波长为290～450 nm条件下测定荧光光谱。

1.2.1.2 咖啡酸对胰脂肪酶的荧光猝灭特性 荧光分子与猝灭剂之间的猝灭效率服从Stern-Volmer方程:

式中:F0是不存在猝灭剂时荧光分子的荧光强度;F是加入猝灭剂后荧光分子的荧光强度;Kq是猝灭常数(该数值越大猝灭效果越明显);τ0是荧光分子的初始平均寿命(生物大分子约为10～8 s);c为咖啡酸浓度(mol/L)。用F0/F对c作图,可以求得Kq值,从而得到不同温度条件下的Stern-Volmer方程。

1.2.1.3 咖啡酸与胰脂肪酶的结合常数(Ka)与结合位点(n)的计算 猝灭剂与荧光物质的结合常数(Ka)与结合位点数(n)符合的方程:

临床资料 两组人群年龄、性别、BMI、吸烟率、收缩压、舒张压、血糖、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、三酰甘油、同型半胱氨酸、C反应蛋白等差异均无统计学意义(P>0.05)(表1)。

式中,F0和F分别为加入咖啡酸前后荧光强度,c为咖啡酸浓度(mol/L)。

根据方程可以作出lg[(F0-F)/F]与lgc之间的直线图,由拟合出的直线斜率和截距便可以求出结合常数以及结合位点数。

1.2.1.4 咖啡酸与胰脂肪酶作用力类型的计算 不同种类的小分子与蛋白质等生物大分子结合力的类型是不一样的,熵变(ΔS)和焓变(ΔH)是判断二者作用类型的主要依据。根据如下热力学参数方程可以计算出咖啡酸和胰脂肪酶之间相互作用的热力学参数。

ΔG=-RTlnKa

式中:ΔG、ΔH和ΔS分别是吉布斯自由能、焓变和熵变;R为气体常数(R=8.314);(Ka)1和(Ka)2分别是温度T1和T2条件下的结合常数。

1.2.2 咖啡酸对胰脂肪酶抑制活性 胰脂肪酶活性测定具体方法参照文献方法[13]。

酶活力(μmol/min·L·g)

式中:V样为消耗NaOH的体积(mL);V空为空白管消耗NaOH的体积(mL);c为NaOH浓度(mol/L);t为反应时间(min);N为酶液稀释倍数。

1.2.3 咖啡酸对胰脂肪酶抑制类型 测定咖啡酸抑制酶的作用类型,可以通过改变底物浓度而保持其他抑制剂和其他组分不变的方法。加入橄榄油的体积分别为1、2、3、4 mL测定酶促反应的初速率。在保持实验溶液总体积不变的条件下,加入橄榄油的体积差用Tris-HCl缓冲溶液补充。然后采用Lineweaver-Burk双倒数作图法,将反应初速率的倒数1/V作为纵坐标,底物浓度的倒数1/[S]作为横坐标作图,判断咖啡酸对胰脂肪酶的抑制作用类型。

1.2.4 金属离子对于咖啡酸与胰脂肪酶相互作用的影响 在探究金属离子对咖啡酸脂肪酶相互作用影响时,实验条件同1.2.1.1,用移液枪在咖啡酸-胰脂肪酶混合溶液中分别加入0.3 mL浓度为4×10-4mol/L的CaCl2、FeCl3、CuSO4、FeCl2溶液,混匀,在37 ℃温度条件下静置5 min后进行分析。

表1 咖啡酸对胰脂肪酶荧光猝灭Stern-Volmer方程和猝灭常数Table 1 Stern-Volmer equation and constant of fluorescence disappearance of caffeic acid on PPL

2 结果与讨论

2.1 咖啡酸与胰脂肪酶相互作用的荧光分析

2.1.1 荧光光谱分析 图1表示25 ℃和37 ℃条件下,咖啡酸浓度微量变化对于胰脂肪酶荧光强度的影响,可以看出,随着咖啡酸浓度的增大荧光强度有规律的降低,发生了荧光猝灭,两种温度下表现出相同的趋势,最大发射波长均红移7 nm。结果表明微量咖啡酸的加入迅速与胰脂肪酶结合导致胰脂肪酶构象的改变。胰脂肪酶在340 nm处呈现最大荧光发射峰,说明荧光主要来源于色氨酸残基,Burstein[14]认为色氨酸残基部分暴露于水相中最大峰位为340～342 nm,而完全暴露于水中最大峰位为350～352 nm,咖啡酸的加入使胰脂肪酶最大峰位发生红移说明咖啡酸的加入改变了色氨酸的微环境,使色氨酸从部分暴露向完全暴露转变。实验室研究表明芦丁和绿原酸同样具有荧光猝灭作用,文献报道茶叶儿茶素、表没食子儿茶素对胰脂肪酶具有荧光猝灭作用[15-16]。

图1 咖啡酸对胰脂肪酶荧光作用的影响Fig.1 Effect of caffeic acid concentration on fluorescence spectrum of PPL注:图中曲线由上到下的咖啡酸浓度依次为0、0.909×10-5、1.818×10-5、2.727×10-5、3.636×10-5、4.545×10-5、5.455×10-5、7.273×10-5、8.182×10-5、9.091×10-5 mol/L。

2.1.2 咖啡酸对胰脂肪酶的荧光猝灭特性 荧光猝灭主要有动态猝灭、静态猝灭和非辐射能量转移3种,荧光分子与猝灭剂之间的猝灭效率服从Stern-Volmer方程,不同温度下Stern-Volmer方程和猝灭常数见表1。由表1可知,25 ℃时,Kq值为(1.24±0.10)×1012L/(mol·s),37 ℃时Kq值为(1.88±0.12)×1012L/(mol·s),所得Kq远高于由碰撞引起的最大猝灭效应常数(2×1010L/(mol·s)),这表明在低浓度时,咖啡酸对胰脂肪酶的荧光猝灭不是由碰撞造成的,而是由于静态猝灭造成的[17]。

2.1.3 咖啡酸与胰脂肪酶的结合常数(Ka)与结合位点(n) 静态猝灭中,结合常数(Ka)与结合位点(n)计算结果见表2。由表2可知,两种温度下咖啡酸与胰脂肪酶的相互作用均表现出较强的结合力,而且随着温度的升高,结合力增强,结合位点数也增大,说明结合反应是吸热反应。

表2 咖啡酸与胰脂肪酶的结合常数和结合位点数Table 2 Binding constant and site of caffeic acid with PPL

2.1.4 咖啡酸与胰脂肪酶作用力类型 根据热力学方程分别计算不同温度下热力学参数,具体结果见表3。

表3 咖啡酸与胰脂肪酶结合的热力学参数Table 3 Thermodynamic parameters of interaction between PPL and caffeic acid

由表3可知,两种温度下ΔG<0,表明咖啡酸与胰脂肪酶的结合是自发进行的;ΔH>0,说明咖啡酸与胰脂肪酶的结合反应是吸热过程,升温将有利于反应进行,结合常数Ka将变大,这与表2结果一致;当ΔH>0且ΔS>0时,作用力主要表现为疏水作用力[18],表明咖啡酸与胰脂肪酶结合主要靠疏水作用力。Haslam等研究多酚与蛋白质作用机理,认为多酚先通过疏水作用向蛋白质分子表面聚集,进行疏水区然后再发生多点氢键结合[19]。

2.2 咖啡酸对胰脂肪酶抑制类型及抑制活性

由图2可知,咖啡酸加入后使得胰脂肪酶的Km值无变化,Vmax值下降,所以其抑制类型表现为非竞争性抑制。咖啡酸不仅能与游离胰脂肪酶(E)结合,而且与酶-底物络合物(ES)结合,但结合常数不同。因此可以得出结论:咖啡酸对胰脂肪酶的抑制类型为非竞争性抑制作用,但抑制作用容易受到外界条件、微环境的影响,较不稳定。相同条件下,随着咖啡酸浓度的增加抑制活性逐渐增强,其IC50为(0.88±0.07) mg/mL,其活性显著的强于绿原酸,与文献报道一致[20]。研究报道了燕麦的乙醇提取物具有较强的胰脂肪酶抑制活性,与酚酸存在着协同效应[21]。

图2 咖啡酸对胰脂肪酶抑制作用的Lineweaver-Burk图Fig. 2 Lineweaver-Burk curvefor the inhibition of caffeic acid on pancreatic lipase

2.3 金属离子对于咖啡酸与胰脂肪酶相互作用的影响

金属离子往往会参加机体的生化反应,进一步研究金属离子存在条件下咖啡酸与胰脂肪酶的结合特性更有实际意义。由表4可知,金属离子存在条件下咖啡酸与胰脂肪酶的结合特性受到影响。结果表明:四种金属离子的存在结合常数和结合位点数均增加,说明四种金属离子都一定程度上促进了咖啡酸与胰脂肪酶的结合,其中Fe3+的作用最显著,强度大小为Fe3+>Fe2+>Cu2+>Ca2+。然而,这种作用源于多方面影响的综合作用,它们可以通过改变酶的微环境及改变抑制剂与酶的结合等多种方式来影响酶的催化特性。

表4 金属离子对于咖啡酸与胰脂肪酶相互作用的影响Table 4 Effect of the interaction betweencaffeic acid and PPL by metal ion

3 结论

荧光光谱法研究表明咖啡酸与胰脂肪酶存在相互作用,荧光光谱分析可知,咖啡酸的加入产生了荧光猝灭现象,最大发射波长略微红移,而且猝灭呈现规律性的变化,说明咖啡酸与胰脂肪酶的结合改变了酶的结构,从而抑制了胰脂肪酶活性,金属离子在一定程度上增强了咖啡酸与胰脂肪酶的结合。通过计算分析得知猝灭主要为静态猝灭,热力学常数计算表明咖啡酸与胰脂肪酶相互作用是自发进行的吸热过程,主要作用力为疏水作用力。

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Study on the interaction between caffeic acid and pancreatic lipase by fluorescence spectroscopy

FAN Jin-bo1,WANG Xiao-lu1,JIANG Hai-jing2,ZHOU Su-zhen1

(1.College of Food Science and Technology,Bohai University,Food Safety Key Lab of Liaoning Province,National & Local Joint Engineering Research Center of Storage,Processing and Safety Control Technology for Fresh Agricultural and Aquatic Products,Jinzhou 121013,China;2.The Center of Comprehensive Occupation Technology Education in Fengrun District of Tangshan City,Tangshan 064000,China)

The interaction between chlorgenic acid and porcine pancreas lipase(PPL)was researched by fluorescence spectrophotometer,including the fluorescence quenching properties,calculating the binding constants and binding sites,inhibitory activity and inhibitory type of caffeic acid on porcine pancreatic lipase,effect of metal ions on the interaction. Experimental results showed that caffeic acid of had strong fluorescence quenching effect on porcine pancreas lipase,maximum absorption wavelength redshift,mainly belongs to static quenching. Binding constant under 25 ℃ and 37 ℃ 6.48×104L/mol and 1.38×105L/mol respectively,and the thermodynamic parameters Δ H>0 and Δ S>0,showed that combination was a spontaneous endothermic reaction,the main force of hydrophobic forces. Inhibitory type of caffeic acid on pancreatic pancreatic lipase was noncompetitive inhibition,inhibitory activity was IC50(0.88± 0.07)mg/mL. When there were four kinds of metal ion(Cu2+,Ca2+,Fe3+,Fe2+)binding constant and binding points were increased,that metal ions,to a certain extent,promoted the combination of caffeic acid and pancreatic lipase.

pancreas lipase;caffeic acid;fluorescence quenching;metal ion;inhibitory activity

2016-06-30

范金波(1977-)，男，博士，副教授，主要从事食品生物化学方面的研究，E-mail：jinbo_fan@hotmail.com。

TS255.1

A

1002-0306(2017)02-0152-05

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.020