绿豆种子萌发过程中酚类化合物的动态变化

陈 丽,黄学勇,张婷婷,罗丽萍

(南昌大学生命科学学院,江西南昌 330031)

绿豆种子萌发过程中酚类化合物的动态变化

陈 丽,黄学勇,张婷婷,罗丽萍*

(南昌大学生命科学学院,江西南昌 330031)

建立了同时测定绿豆醇提液中19种酚类化合物的高效液相色谱(High performance liquid chromatography,HPLC)方法,并结合标准品对绿豆种子萌发过程中19种酚类化合物进行了定性定量分析。结果表明,在绿豆种子萌发过程中,酚类化合物种类和总量均有所增加,其中没食子酸和咖啡酸含量随萌发时间的显著延长而增加;芦丁、黄豆苷元、山奈酚、p-香豆酸、阿魏酸和染料木素含量在第7 d有最大值,分别为1574.5、114.3、80.3、43.3、207.9和45.3 μg/g;槲皮素含量在第4 d有最大值28.0 μg/g;原儿茶酸、橙皮苷、肉桂酸和柚皮素含量在第5 d有最大值,分别为89.1、297.4、84.6和30.6 μg/g;白藜芦醇、对硝基苯甲酸和鹰嘴豆芽素A含量在第2 d有最大值,分别为89.6、70.8和237.0 μg/g;杨梅酮、儿茶素和橙皮素含量在第6 d有最大值,分别为40.7、712.1和58.2 μg/g。而19种酚类化合物总含量在第7 d有最大值,达到3508.8 μg/g。在绿豆种子萌发过程中,由于酶种类增多、活性增强,导致次级代谢产物大量合成,酚类化合物含量增多。

绿豆,种子萌发,高效液相色谱(HPLC),酚类化合物

绿豆(Mung bean)是豆科(Leguminosae)豇豆属(Vigna)植物绿豆(VignaradiataL.)的成熟种子,在我国种植广泛,主要分布在热带及亚热带地区[1],是广受欢迎的药食两用食物[2]。绿豆不仅富含蛋白质,而且含有丰富的类胡萝卜素、抗坏血酸、皂苷、类黄酮等抗氧化性成分[3-4],可预防心血管疾病、降低慢性疾病风险等,是良好的抗氧化性食品[5]。绿豆芽(Mung bean sprout),别名豆芽菜,是绿豆种子在适宜条件下萌发生长出的嫩芽,主要食用部分为下胚轴,是一种传统的芽类蔬菜[6]。据报道,绿豆的营养品质可以通过发芽得到提高[7],例如,绿豆种子在萌发过程中,由于酶的种类增加、酶活性增强,导致呼吸作用加强[8-9],脂肪、还原糖等被大量水解,使蛋白质、维生素、自由氨基酸、异黄酮、总酚酸等含量增加[10-11]。

酚类化合物是一类重要的生物活性物质,常常作为抗氧化剂应用于食品当中[12-13],具有降血压、降血脂、软化血管等功效[14]。绿豆种子富含酚类化合物[15-16],在萌发过程中,由于酶活性提高,植物体水解反应加快,导致次级代谢产物大量合成[17-18],从而使酚类含量增加。Tang等人[10]研究发现山奈酚、芦丁、染料木素、咖啡酸等是萌发代谢过程中主要的多酚类物质,在萌发过程中,这些酚类化合物的含量发生了明显的变化。Huang等人[8]研究发现,种子萌发过程中异黄酮水平明显提高,染料木素含量相较于对照组高出3倍。López等[19]人研究发现,种子萌发过程中,酚类化合物被大量合成,使抗氧化能力增强。但是,对于绿豆种子萌发过程中酚类化合物的动态变化的研究报道不多。

表1 梯度洗脱流动相比例Table 1 Ratio of mobile phases for gradient elution

为了更加详细地了解绿豆种子在萌发过程中酚类化合物的动态变化,本文拟采用高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HPLC),定性定量分析绿豆种子在萌发过程中19种酚类化合物的代谢变化,找出酚类化合物在萌发过程中的变化规律,为合理食用绿豆芽及食品研发方面提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

绿豆(VignaradiataL. Wilczek)种子 东北明绿豆,2015年产自中国吉林省白城市通榆县;阿魏酸(Ferulic acid,Fe),肉桂酸(Cinnamic scid,Ci),柚皮素(Naringenin,N),槲皮素(Quercetin,Q),山奈酚(Keampferol,K),染料木素(Genistein,Ge)和p-香豆酸(p-Coumaric,p-c) 购自中药固体制剂制造技术国家工程研究中心;没食子酸(Gallic acid,Ga),儿茶素(Catechin,Cat),咖啡酸(Caffeic acid,Ca)和芦丁(Rutin,R) 中国食品药品检定研究院;杨梅酮(Myricetin,My),对硝基苯甲酸(4-nitrobenzoic acid,Ni) 购自Sigma-Aldrich;白藜芦醇(Resvaratrol,Re),黄豆苷元(Daidzein,Da),橙皮素(Hesperetin,H),鹰嘴豆芽素A(Biochanin A,Bi) 购自阿拉丁试剂;橙皮苷(Hesperetin,He),原儿茶酸(Protocatechuic acid,Pr) 购自百灵威试剂;芦丁和杨梅酮 纯度≥95%,其余标准品纯度≥98%;甲醇和乙腈 色谱级(德国默克);乙醇 分析纯;甲酸 优级纯;实验用水 超纯水。

美国Agilent 1200型高效液相色谱仪 包括在线脱气装置,四元泵,柱温箱,光电二极管阵列检测器(DAD),手动进样装置,及G2170BALC化学工作站;RE-52AA旋转蒸发仪 上海亚荣生化仪器厂;GZX-9140MBE电热鼓风干燥箱 上海博讯实业有限公司医疗设备厂;GXZ-380B人工气候箱 宁波东南仪器有限公司;KQ3200DE数控超声波清洗仪 昆山市超声仪器有限公司;TDL-5-A低速离心机 上海安亭科学仪器厂;Master超纯水系统Master-S plus UF 上海和泰仪器有限公司;DFT150直立式多功能粉碎机 温州顶历医疗器械有限公司;AR1140电子分析天平(精度0.0001 g) 梅特勒-托利多(上海)仪器有限公司。

1.2 样品制备

1.2.1 种子前处理及萌发 精选一定量色泽新鲜、籽粒饱满的优质绿豆,用蒸馏水漂洗3～4次,然后用2%次氯酸钠消毒10 min后用无菌水冲洗3～4遍。在9 cm的培养皿内垫2层滤纸作发芽床,每皿放25粒绿豆,以5个培养皿为1个处理,每个处理重复3次,培养皿置于25 ℃、100% RH人工气候箱中暗培养,保持滤纸湿润。

1.2.2 绿豆醇提液制备 随机取出一定量各组发芽的绿豆,对照组(CK)为未发芽绿豆种子,放入40 ℃的鼓风干燥箱内干燥至恒重,粉碎、过40目筛,粉末密封,于-20 ℃保存备用。分别称取2.0 g各组绿豆粉末,用70%(V:V)乙醇,料液比为1∶20[20],50 ℃于150 W下超声提取40 min,3500 r/min离心5 min,滤渣重复提取1次,合并上清液,旋转蒸发后将浓缩液转入10 mL容量瓶中,用70%甲醇定容,获得绿豆醇提液(Ethanol extract of mung bean,EEM)。将EEM放入-20 ℃冰箱中保存,备用。

1.2.3 标准品溶液的配制 分别称取19种干燥至恒重的标准品5.0 mg,用甲醇溶解,配制成1 mg/mL标准品溶液,于-18 ℃避光保存,作为储备液,其他浓度标准品溶液用储备液在70%甲醇稀释下得到。

1.3 HPLC条件

色谱柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18色谱柱(4.6 mm×150 mm×5 μm);流动相:乙腈(流动相A)和0.2%甲酸-水溶液(流动相B);流速:1.0 mL/min;柱温:35 ℃;检测波长:256 nm、280 nm;进样量20 μL。采用梯度洗脱,条件见表1。

1.4 标准曲线的绘制

将表2所示，混合标准品溶液用70%甲醇稀释成6组不同的浓度梯度,按低到高浓度依次进行HPLC分析,平行测定3次,以平均峰面积y对标准品进样质量x(μg)进行线性回归,得出各标准品的回归方程、线性范围和相关系数。以信噪比(S/N=3)确定各物质的最低检测限(LOD)。

表2 混合标准品溶液中各标准品浓度Table 2 Concentration of each standard in mixed standards solution

1.5 样品分析

将EEM和标准品溶液分别用0.45 μm有机滤头过滤,滤液进HPLC分析。EEM和标准品溶液的分析结果利用G2170BALC化学工作站中的光谱数据和回归时间进行一一比对,再结合各标准品的标准曲线,从而对EEM中19种酚类化合物进行定性定量分析。

1.6 加标回收率的计算

回收率(%)=(测得量-原有量)∕加入量×100

1.7 数据分析

采用SPSS 19.0统计软件(IBM SPSS Statistics)进行数据处理,利用中药指纹图谱软件进行图谱相似度分析。

2 结果与分析

2.1 HPLC条件的优化

分别在220、256、280、320和360 nm 5个波长下检测混合标准品,发现在256 nm和280 nm检测波长下出峰数及分离效果较好。在综合考虑峰形、信号响应强弱、负峰等情况后,最终确定将标准品分为两组(见表2),分别在256 nm和280 nm下检测,分组后混合标准品的分离效果较好(图1)。

图1 256 nm(a)和280 nm(b)波长下两组混合标准品的HPLC谱图Fig.1 HPLC chromatograms of 19 mixed standardsafter grouping detected under 256 nm(a)and 280 nm(b)注:1:没食子酸;2:原儿茶酸;3:儿茶素;4:咖啡酸;5:p-香豆酸;6:阿魏酸;7:芦丁;8:橙皮苷;9:杨梅酮;10:白藜芦醇;11:黄豆苷元;12:肉桂酸;13:槲皮素;14:柚皮素;15:染料木素;16:山奈酚;17:橙皮素;18:对硝基苯甲酸;19:鹰嘴豆芽素A。

2.2 方法学考察结果

2.2.1 线性关系与检出限 将不同浓度梯度的混合标准品进行HPLC分析,得各标准品的线性范围、回归方程、检出限等见表3。各标准品的相关系数均在0.9897～0.9999之间,表明在一定浓度范围内各标准品质量与峰面积相关性良好。各标准品的LOD最小的为0.4 μg/L(染料木素),最高的为58.1 μg/L(对硝基苯甲酸),表明高效液相色谱灵敏度较好,符合HPLC的定量要求。

2.2.2 精密度实验 分别将两组混合标准品溶液按表1所示条件进HPLC分析,每6 h测定一次,共测6次,考查保留时间及峰面积的重现性。结果如表4所示,发现各色谱峰峰面积的相对标准偏差(RSD)在1.19%～5.50%之间,保留时间的RSD在0.45%～5.37%之间,说明两组混合标准品在测定时间内性质稳定。

2.2.3 稳定性实验 将配制好的混合标准品溶液,放在4 ℃冰箱下保存,每隔2 h测定一次,后每隔1 d测定一次,连测4 d,考查混合样品中各标准品的稳定性,结果如表4所示。发现各色谱峰峰面积的RSD在0.93%～5.66%之间,保留时间的RSD在0.26%～4.59%之间,说明两组混合标准品在测定时间内性质稳定。

表3 混合标准品保留时间、线性范围、校正曲线及最低检测限结果Table 3 Results of retention time,linear range,calibration curves and LOD of mixed standards

注:*表示检测波长为256 nm;**表示检测波长为280 nm。

表5 样品的重复性Table 5 Repeatability of sample

表4 混合标准品的精密度、稳定性和加标回收率Table 4 Precision and stability and recovery of mixed standards

图2 在256 nm和280 nm波长下萌发1～7 d各绿豆醇提液的HPLC指纹图谱Fig.2 HPLC typical chromatograms of each samples ethanol extract during mung bean Seeds germination 1～7 d under 256 nm and 280 nm

2.2.4 重复性实验 以20 mg/mL EEM为检测对象,经0.45 μm有机滤膜过滤后进样,每6 h测定一次,共测6次,考查保留时间及峰面积的重现性,结果见表5。发现色谱峰的个数和特征一致,主要色谱峰峰面积的RSD在1.21%～6.17%之间,保留时间的RSD在0.64%～3.50%之间,表明重复性良好,符合定量分析要求。

2.2.5 加标回收率 准确称取2 g绿豆样品,分别加入已知量的混合标准品溶液,充分混匀,按1.2.2中所述方法提取,在如表1的色谱条件下分别以20 μL进样5次。结果如表4所示,发现标准品回收率在89.39%～106.82%之间,说明各标准样品在提取过程中损失不大,提取方法和成分的稳定性符合定量分析要求

2.3 EEM的HPLC图谱相似度分析

分别对萌发1～7 d EEM进行了HPLC分析,并建立了256 nm和280 nm波长下EEM酚类化合物指纹图谱,见图2。从图2中可明显看出,绿豆种子在萌发过程中,酚类化合物种类和含量均有明显变化。对EEM图谱进行了相似度分析(见表6),发现256 nm下各个谱图的相似度在0.322～0.919之间,280 nm下在0.347～0.624之间,其中第2 d和第7 d的谱图与其它谱图差异大,说明在第2 d和第7 d,EEM中物质变化较大。

表6 EEM 指纹图谱相似度分析Table 6 Similarity analysis for typical HPLC chromatograms ethanol extract of mung bean

图3 绿豆种子在萌发1～7 d过程中19种酚类化合物的含量变化Fig.3 Content changes of 19 kinds of phenolic compounds in mung bean seeds during germination 1～7 day注:不同小写字母表示不同萌发时间之间差异显著(p≤0.05)。

2.4 EEM中酚类化合物的定性定量分析

结合标准品对绿豆萌发过程中19种酚类化合物进行了定性定量分析。结果表明,绿豆在萌发1～7 d过程中,19种酚类化合物在第5 d全部检出,其中没食子酸和咖啡酸含量随萌发时间的延长而增加,见图3(A);芦丁、黄豆苷元、山奈酚、p-香豆酸、阿魏酸和染料木素含量在第7 d达到最大值,分别为1574.5、114.3、80.3、43.3、207.9和45.3 μg/g,见图3(B);槲皮素含量在第4 d达到最大值,原儿茶酸、橙皮苷、肉桂酸和柚皮素含量在第5 d达到最大值,分别为28.0、89.1、297.4、84.6和30.6 μg/g,见图3(C);白藜芦醇、对硝基苯甲酸和鹰嘴豆芽素A含量在第2 d达到最大值,分别为89.6、70.8和237.0 μg/g,见图3(D);杨梅酮、儿茶素和橙皮素含量在第6 d达到最大值,分别为40.7、712.1和58.2 μg/g,见图3(E);而绿豆种子在萌发过程中,19种酚类化合物总含量在第7 d有最大值3508.8 μg/g,见图3(F)。

3 结论与讨论

本文建立了同时测定绿豆醇提液中19种酚类化合物的HPLC方法,并用该方法对绿豆种子萌发1～7 d过程的19种酚类化合物进行了定性定量检测,研究表明绿豆种子在萌发过程中19种酚类化合物的种类和总量均发生了明显的变化。

绿豆种子在萌发初期,在呼吸作用和吸胀作用的条件下,主要黄酮C-糖苷被内源性β-葡糖苷酶水解成糖苷配基芹黄素,也有可能从水解糖苷中获得小分子物质如单糖提供能源,从而促进次生代谢产物的合成[21]。在萌发中期,由于苯丙氨酸裂合酶(PAL)活性增强以及氢氧根和配糖苷的加入,使得山奈酚、咖啡酸、槲皮素等酚类化合物含量增加。在萌发后期,可能由于在呼吸作用下,更多的活性氧和羟基自由基被合成[8,21],使膜脂质过氧化作用增强,导致含氧类黄酮增加,如芦丁、儿茶素、染料木素等。研究结果为常用药食同源植物绿豆中酚类化合物的含量提供了数据参考,具有较强的食用价值,也为研究绿豆种子萌发过程中的代谢组学提供了理论基础。

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The contents dynamic change of phenolic compounds during the germination of mung bean seeds

CHEN Li,HUANG Xue-yong,ZHANG Ting-ting,LUO Li-ping*

(School of Life Sciences,Nanchang University,Nanchang 330031,China)

This paper established a high performance liquid chromatography(HPLC)method for simultaneous determination of 19 kinds phenolic compounds in ethanol extract of mung bean(EEM),analysis of these chemical components during germination for 1～7 days by combining with the referent standards. The results showed that the type and total content of phenolics and polyphenolic increased during the germination. Gallic acid and caffeic acid contents increased during germination. Rutin,daidzein,keampferol,p-coumaric,ferulic acid and genistein reached their maximum levels at the 7th day,respectively 1574.5,114.3,80.3,43.3,207.9 and 45.3 μg/g. Quercetin contents at the 4th day had a maximum of 28.0 μg/g. Protocatechuic acid,hesperetin,cinnamic scid and naringenin contents showed their maximum levels at the 5th day,respectively 89.1,297.4,84.6 and 30.6 μg/g. Contents of resvaratrol,4-nitrobenzoic acid and biochanin A had their maximum at the 2th day,respectively 89.6,70.8 and 237.0 μg/g. Myricetin,protocatechuic acid and hesperetin exhibited their maximum levels at the 6th day,respectively 40.7,712.1 and 58.2 μg/g. The total content of 19 kinds of phenolic compounds at the 7th day had the maximum value,reaching 3508.8 μg/g. During the germination of mung bean seeds,due to more types of enzyme and activity increased,more secondary metabolites were synthesized,so phenolic compounds contents increased.

mung bean;seed germination;high performance liquid chromatography(HPLC);phenolic compounds

2016-07-06

陈丽(1991-)，女，硕士研究生，研究方向：植物次生代谢产物，E-mail：1447169754@qq.com。

*通讯作者:罗丽萍(1972-)，女，博士，教授，主要从事植物学新技术、新方法，植物次生代谢产物方面的研究，E-mail：lluo2@126.com。

江西省教育厅项目(KJLD12051)；江西省科技厅项目(20123BCB22004)。

TS201.2

A

1002-0306(2017)02-0156-06

10.13386/j.issn1002-0306.2017.02.021