酶解鳙鱼蛋白制备活性肽的研究

周燕芳++郑荣彬

摘要：以鳙鱼（Aristichthysnobilis）魚肉蛋白为原料，采用木瓜蛋白酶对鳙鱼蛋白进行酶解，制备具有抗氧化活性的可溶性肽。研究酶浓度、底物浓度、温度、时间、pH对水解度和DPPH·自由基清除率的影响。通过正交试验设计对酶解工艺进行优化。结果表明，酶解的最佳条件是酶浓度1 400 U/g，底物浓度3.0%，温度60 ℃，酶解2 h，pH 7.0，在此条件下，所得可溶性肽的活性最高，对DPPH·自由基的清除率为69.09%，对羟自由基的清除率为75.22%，对O2-·自由基的清除率为61.92%。

关键词：鳙鱼（Aristichthysnobilis）蛋白；木瓜蛋白酶；控制酶解；自由基；清除率

中图分类号：TS254.9 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2017）01-0115-04

DOI：10.14088/j.cnki.issn0439-8114.2017.01.029

Study on Preparation of Active Peptide with Bighead Carp Protein by Enzymolysis

ZHOU Yan-fang，ZHEN Rong-bin

（School of Chemical and Environmental Engineering，Hanshan Normal University，Chaozhou 521041，Guangdong，China）

Abstract：Using bighead carp（Aristichthysnobilis） protein as materials，the preparation of active peptide from bighead carp protein by enzymatic hydrolysis with papain was studied. The effects of enzyme concentration， substrate concentration，temperature，time and pH value on the degree of hydrolysis and removal of DPPH-free radical were studied. By orthogonal design， the results showed that when the enzyme concentration was 1 400 U/g， and the substrate concentration was 3.0%， temperature was 60 ℃， enzymatic hydrolysis time was 2 h， pH was 7. The scavenging rate of DPPH· free radical reached 69.09%，the removal rate of ·OH and O2-· reached 75.22% and 61.92%.

Key words：bighead carp（Aristichthysnobilis） protein；papaya；controlled-enzymatic hydrolysis；free radicals；antioxidant ability

鳙鱼（Aristichthysnobilis）又叫花鲢、胖头鱼、包头鱼等。鳙鱼的生长速度比鲢鱼快，是较宜养殖的优良鱼种之一，为中国主要的淡水养殖鱼之一。由于传统消费习惯的原因，人们对鳙鱼头有特别的嗜好，造成鱼身和鱼尾部分价格大跌，再加上鳙鱼具有土腥味，造成大量鱼肉低价售卖，甚至作为饲料，造成极大的浪费。

关于鳙鱼研究，国内目前主要集中在鳙鱼的养殖、鱼病防治等方面，对其深加工研究较少，且涉及加工的主要集中在传统加工产品如冷冻鱼、烟熏鱼、鱼干等，如熊光权等[1]进行了以鳙鲢鱼为原料制备鱼肉香肠的研究，青岛海洋大学通过研究发现鳙鱼属于凝胶形成困难、凝胶劣化容易的鱼种，不适宜加工为鱼糜制品[2]，必须寻求新的途径来提高其附加值。水产保健食品作为一种有较长生命力的产品，不仅产品附加值高，而且原料不受冰冻影响，生产不受季节限制。目前，市场上已出现一些利用牡蛎、螺旋藻、鱼子、鱼油等生产的保健食品，而水产活性肽制品则相对较少，且主要集中在海洋生物肽产品方面[3]，鲜见以鳙鱼为原料开发保健食品的研究。通过控制酶解，鱼肉中呈惰性的生物活性肽被释放出来，表现出抗氧化、促进钙质吸收、增强机体免疫力、促进肉芽增生从而加速伤口愈合等生理功效[4]。因此，结合中国的具体情况，选择蛋白质含量高，但利用率不高或生物价不高的廉价鱼作为原料，通过酶解等生物手段，制备活性肽，为鳙鱼的深加工提供一条新途径，增加经济效益。本研究以鳙鱼鱼肉蛋白为原料，采用木瓜蛋白酶对鳙鱼蛋白进行酶解，制备具有抗氧化活性的可溶性肽，以期为鳙鱼的深加工提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

鳙鱼购买于广东省潮州市南桥市场；1，1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH·自由基）购于Sigma公司；木瓜蛋白酶（BR，酶活力5万U/g）购于江西锐阳生物科技有限公司；其他试剂均为分析纯。

1.2 仪器

KW1000DC型电热恒温水浴锅（上海恒平科学仪器有限公司）；AUY220型分析天平（日本岛津公司）；KDN-103F型定氮仪（上海纤检仪器有限公司）；101-2AB型电热鼓风干燥箱（天津市泰斯特仪器有限公司）；PHS-3C型精密级数字式酸度计（上海手术器械厂）；TU-1901型紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司）。

1.3 方法

1.3.1 指标测定 蛋白质的测定采用微量凯氏定氮法[5]；游离氨基酸的测定采用双指示剂甲醛滴定法[6]；总氮量的测定采用微量凯氏定氮法[5]；水解度的计算：水解度=（水解产生游离氨基酸态氮量/原料总氮含量）×100%[7]，其中水解产生游离氨基态氮量=水解后酶解液中的游离氨基氮-原料中的游离氨基氮。

多肽活性的测定：DPPH·自由基清除率的测定参考文献[8]，·OH自由基清除效果的测定参考文献[9]，O2-·自由基清除效果的测定参考文献[10]。

1.3.2 鳙鱼鱼肉蛋白酶解工艺 将鳙鱼去鳞、去鱼皮，鱼肉蒸熟，去鱼骨，在电热鼓风机干燥，粉碎，脱脂得到鳙鱼蛋白粉，下称“鱼粉”。称取适量鳙鱼蛋白粉，加入一定比例的去离子水，匀浆后调整pH，加入一定量的木瓜蛋白酶于反应溶液中，搅拌均匀，置于恒温水浴锅中进行酶解。反应至预定时间后，将其迅速水浴加热10 min使酶失活，进行抽滤，得到滤液，进行相关测定。

1.3.3 单因素试验对鳙鱼蛋白制备活性肽的影响 分别对酶浓度、底物浓度、温度、时间、pH等因素进行研究，考察各因素对水解度及DPPH·自由基的清除率的影响。

1）酶浓度的影响。准确称取一定量鱼粉，加入一定量去离子水，配制成浓度为2.0%的鱼糜液，在温度为60 ℃，pH为7的条件下，酶解时间4 h，酶浓度是1 000、1 200、1 400、1 600、1 800、2 000 U/g。

2）底物浓度的影响。准确称取一系列不同质量的鱼粉，分别加入一定量去离子水，配制成底物浓度为1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、3.5%的鱼糜液，在60 ℃下，温度为60 ℃，pH为7的条件下，酶解时间4 h，酶浓度是1 800 U/g进行酶解。

3）时间的影响。分别准确称取一定量鱼粉，加入一定量的去离子水，配制成底物浓度为3.0%的鱼糜液，在60 ℃下，酶浓度是1 800 U/g，温度为60 ℃，pH为7的条件下，酶解时间分别为1、2、3、4、5、6 h进行酶解。

4）温度的影响。分别准确称取一定量鱼粉，加入一定量的去离子水，配制成底物浓度为3.0%的鱼糜液，在酶浓度是1 800 U/g，温度为60 ℃，pH为7的条件下，酶解时间4 h，酶解温度分为45、50、55、60、65、70 ℃进行酶解。

5）pH的影响。分别准确称取一定量鱼粉，加入一定量的去离子水，配制成底物浓度为3.0%的鱼糜液，在60 ℃下，酶浓度是1 800 U/g，温度为60 ℃，酶解时间为4 h，酶解的pH分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5进行酶解。

各单因素试验酶解后抽滤，测定水解度和对DPPH·自由基的清除率。

1.3.4 正交试验优化鳙鱼肉蛋白活性肽制备条件 综合各单因素试验结果，以酶浓度、底物浓度、时间、温度、pH 5个因素进行5因素4水平正交试验设计，试验因素和水平见表1。

2 结果与分析

2.1 单因素试验结果

2.1.1 不同酶浓度对鳙鱼肉蛋白活性肽DPPH·自由基清除率的影响 从图1可知，随着酶浓度的增大，水解度和DPPH·清除率均有所增加，当酶浓度从1 000 U/g增加到1 600 U/g时，随着酶浓度的增高，鳙鱼鱼肉蛋白被木瓜蛋白酶逐步水解，多肽逐渐形成，水解度和DPPH·清除率均增加，但当酶浓度高于1 600 U/g时，随着酶浓度的增高，多肽被木瓜酶进一步水解，水解度略有增加，而DPPH·清除率也有所下降；虽然酶浓度为1 800 U/g时，水解度达到最高点，但DPPH·清除率反而有所下降，这可能是由于多肽进一步水解为氨基酸。为了得到活性较高的多肽，选择酶浓度为1 600 U/g。

2.1.2 不同底物浓度对鳙鱼肉蛋白活性肽DPPH·自由基清除率的影响 从2图可知，底物浓度对木瓜蛋白酶水解鳙鱼具有一定影响。随着底物浓度的增加，鳙鱼鱼肉蛋白酶解产物的水解度随之下降，而DPPH·清除率呈上升的趋势。这是因为在底物浓度小于2.5%时，随底物浓度的增多，鳙鱼鱼肉蛋白被木瓜蛋白酶逐步水解，多肽逐渐形成，故DPPH·清除率呈上升趋势，虽然蛋白质分解为多肽的量有所增加，但底物浓度的增加使总氮量大量增加，遠远大于分解为多肽的增加量，故水解度下降；当底物浓度为3.0%时，其DPPH·清除率为最高值，而当底物浓度大于3.0%时，蛋白质的分解受到酶浓度的限制，其DPPH·清除率变化较小，故为获得活性较大的多肽，在酶解过程中底物浓度控制在3.0%左右比较合适。

2.1.3 酶解时间对鳙鱼肉蛋白活性肽DPPH·自由基清除率的影响 从图3可知，随着酶解时间的延长，鳙鱼鱼肉蛋白酶解产物的DPPH·清除率和水解度缓慢增大，在1～3 h增幅明显，在3 h后其DPPH·清除率变化不大。这可能是由于酶解时间的延长，鳙鱼蛋白被逐步酶解，多肽逐渐形成，水解度上升，1～3 h可能是具有DPPH·清除活性的多肽大量生成的时间，从而表现出DPPH·清除率的明显升高，3 h之后DPPH·清除率变化趋于平稳，因此从经济方面考虑，酶解时间控制在3 h左右比较合适。

2.1.4 酶解温度对鳙鱼肉蛋白活性肽DPPH·自由基清除率的影响 从图4可知，酶解温度对酶解过程有一定的影响。随着温度的升高，鳙鱼鱼肉蛋白酶解产物的水解度和DPPH·逐渐升高，在45～60 ℃增幅明显，在该区间，随着温度的升高，酶的活性增加，鳙鱼蛋白被酶解生成的肽增多，水解度和DPPH·清除率均增多；温度为60 ℃时，酶解产物对DPPH·清除率达到最高值，水解度也达到最高；温度大于60 ℃时，随着温度的增加，水解度和DPPH·清除率均有所下降，可能是温度升高使得部分酶失活，故选择温度为60 ℃比较合适。

2.1.5 pH对鳙鱼肉蛋白活性肽DPPH·自由基清除率的影响 pH对鳙鱼肉蛋白水解度和DPPH·清除率的影响见图5。从图5可知，随着pH的增大，水解度和DPPH·清除率均有所增加，从水解度的曲线来看，pH为7.0时酶的活性最高；pH为6.0～7.0时，随pH的增加，酶的活性增大，故水解度呈上升趋势；当pH大于7.0时，随着pH的增加，酶的活性降低，故水解度呈下降趋势。对于DPPH清除率，随着pH增加，酶的活性先增大后减小，在pH为7.5时，对DPPH·的清除率达到峰值。为了得到活性较大的多肽，故选择pH为7.0。

2.2 正交试验法优化酶解条件

以温度、时间、底物浓度、酶浓度、pH为自变量，以DPPH·清除率为指标，进行正交试验分析。结果如表2所示。由表2可知，影响木瓜蛋白酶酶解鳙鱼蛋白制备抗氧化肽工艺的主次顺序为A>C>E>D>B，即温度>底物浓度>pH>酶浓度>时间。各因素的最优组合为A3B1C3D1E3，即酶浓度为1 400 U/g，底物浓度为3.0%，酶解时间为2 h，温度为60 ℃，pH为7.0，对该条件下进行验证试验，得到的结果是DPPH·自由基清除率为69.09%，均大于正交试验结果。鳙鱼酶解的最佳条件为酶浓度1 400 U/g，底物浓度3.0%，酶解时间2 h，温度60 ℃，pH 7.0。

2.3 最佳条件下所得活性肽的活性测定

在最佳条件下即酶浓度1 400 U/g，底物浓度3.0%，酶解时间为2 h，pH 7.0，温度60 ℃进行酶解，得到活性多肽，其DPPH·自由基清除率为69.09%，对·OH自由基清除率为75.22%，对O2-·自由基清除率为61.92%。

3 小结

本研究以鳙鱼鱼肉蛋白为原材料，以水解度和抗氧化活性为指标，研究了木瓜蛋白酶制备鳙鱼蛋白活性肽的最佳工艺，选用木瓜蛋白酶对鳙鱼鱼肉进行酶解，制备抗氧化肽，通过对酶解产物进行水解度和DPPH·清除率的测定，并以DPPH·清除率为主要指标。在酶解的单因素试验证实温度、时间、底物浓度、酶浓度、pH对木瓜蛋白酶水解鳙鱼蛋白有明显影响。采用正交试验法，对各因素进行最优组合，得到木瓜蛋白酶酶解鳙鱼蛋白制备抗氧化肽的最佳工艺为酶浓度1 400 U/g，底物浓度3.0%，酶解时间2 h，pH 7.0，温度60 ℃，测得DPPH·自由基清除率为69.09%，·OH自由基清除率为75.22%，O2-·自由基清除率为61.92%。

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