单/双磷酸化酪氨酸底物与蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B相互作用分子动力学研究

董振科，刘梦源，程先超，王润玲

（天津医科大学药学院，天津市临床药物关键技术重点实验室，天津300070）

蛋白酪氨酸磷酸酯酶1B（protein tyrosine phosphatase 1B,PTP1B）是第一个被分离、纯化并得到晶体结构的蛋白酪氨酸酯酶[1-2]。PTP1B是一个分子量为37 kD的胞内酶，由PTP1N编码，含435个氨基酸残基。其中30~278个氨基酸组成了催化活性部位[3]。在生理条件下PTP1B起着负反馈调节胰岛素和瘦素信号转导通路的作用。当其活性增强时，可促使磷酸化的胰岛素受体（IR）和它的底物（IRS）以及磷酸化瘦素去磷酸化，从而下调胰岛素和瘦素信号转导过程，减弱胰岛素和瘦素的作用[4-5]。此外，研究人员还发现了PTP1B与癌症治疗密切相关[6-7]。因此，以PTP1B作为药物治疗靶点，开发高亲和力的新型PTP1B抑制剂，已成为最近几年研究的热点领域。Salmeen等[8]的研究发现，双磷酸化酪氨酸底物与PTP1B亲和能力要比单磷酸化酪氨酸底物高70%。Puius等[9]的研究表明，双磷酸化酪氨酸底物拟似物抑制剂与PTP1B结合能要比单磷酸化酪氨酸底物拟似物抑制剂高。所以，进一步研究上述两种不同底物与PTP1B相互作用模式的差异，发现双磷酸化酪氨酸底物与PTP1B高亲和力的原因，可以为开发PTP1B抑制剂提供新的理论基础。

1 材料与方法

1.1 构建分子动力学模拟起始结构 从RCSB蛋白数据库下载人的单磷酸化酪氨酸底物与PTP1B复合物晶体结构（PDB ID:1G1G）和人的双磷酸化酪氨酸底物与PTP1B复合物晶体结构（PDB ID:1G1H）。去除晶体结构中的水分子和其它与分子动力学模拟无关的杂分子，将PTP1B中的Ala215修改为Cys215（野生型PTP1B第215号残基为半胱氨酸）。

利用Desmond 9.0分子动力学软件包[10-11]向上述两个模型中加入简单点电荷水分子（SPC水分子），周期边界条件中将生成的盒子形状定为Cubic，盒子的Buffer值为10魡。向体系中加入反离子，使模拟体系达到电中性，同时再向体系中加入0.15 mol/L的氯化钠，使整个体系与人体体液环境等渗。

1.2 分子动力学模拟参数 分子动力学模拟采用NPT系综，键长限制算法为SHAKE，温度耦合方法为Nose-Hoover，模拟温度为300K。压力耦合方法为Martyna-Tobias-Klein，弛豫时间为2 ps，模拟压力为 1.01325bar，Coupling style 为 Isotropic，可压系数为4.5×10-5。短程静电相互作用阈值为9魡，长程静电作用计算采用Smooth particle mesh Ewald(PME)[12-13]。分子动力学积分步长为2 fs，首先平衡2 ns，，然后进行10 ns的正式分子动力学模拟，每2 ps记录一次轨迹文件。

2 结果

2.1 单磷酸化酪氨酸底物和双磷酸化酪氨酸底物对PTP1B蛋白骨架运动的影响 见图1、2。

由图1可知，在10 ns的分子动力学模拟过程中，单磷酸化酪氨酸底物（1G1G）和双磷酸化酪氨酸底物（1G1H）的存在对于PTP1B蛋白骨架Cα的均方根偏差数值变化影响不大，均在0.6～1.4魡范围内波动。

此外，通过计算两种不同底物作用下，PTP1B的旋转半径随时间变化的曲线（图2），可以看出，在整个分子动力学模拟的过程中，单磷酸化酪氨酸底物与PTP1B复合物（1G1G）和双磷酸化酪氨酸底物与PTP1B复合物（1G1H）的旋转半径随时间变化的差异不大，在19.2～19.5魡的范围内保持稳定波动变化。

通过计算两种不同底物在分子动力学模拟过程中对PTP1B骨架Cα运动和旋转半径变化的影响，可以看出，这两种不同底物对PTP1B蛋白骨架运动的影响不大，说明两种底物与PTP1B结合能力的差异不是通过改变蛋白骨架运动方式实现的[14]。

图1 不同结构复合物Cα的均方根偏差（RMSD）随时间变化曲线Fig 1 The root mean square deviation(RMSD)of Cα atoms for thedifferent systems

图2 不同结构复合物旋转半径随时间变化曲线Fig 2 The gyrate radius of the different systems

2.2 单磷酸化酪氨酸底物和双磷酸化酪氨酸底物对PTP1B活性位点关键残基的影响 见图3。

图3 Asp48残基的侧链二面角分布图Fig 3 Plotsofχ1/χ2dihedralangledistributionforAsp48ofPTP1B

图3是在分子动力学模拟过程中，Asp48侧链二面角的分布情况，从图中可以看出，单磷酸化酪氨酸底物存在情况下PTP1B的Asp48侧链二面角分布在3个区域中；而双磷酸化酪氨酸底物存在时，PTP1B的Asp48侧链二面角只分布在一个区域内。进一步氢键概率情况统计表明，单磷酸化酪氨酸底物中的pTyr1163和Arg1164与PTP1B中Asp48形成氢键的概率分别为0.440和0.337，远远小于双磷酸化酪氨酸底物的pTyr1162和pTyr1163与PTP1B中Asp48形成氢键的概率（分别为0.999和 1.000）。

由此可以推断，磷酸化底物与PTP1B中Asp48形成氢键作用的前提是Asp48侧链二面角χ2分布在0°～120°之间。但单磷酸化酪氨酸底物与Asp48相互作用时，会使Asp48侧链二面角χ2分布在0°～120°之间的概率降低，导致单磷酸化酪氨酸底物与Asp48之间的氢键作用减弱，从而使单磷酸化酪氨酸底物比双磷酸化酪氨酸底物与PTP1B亲和能力降低。

2.3 单磷酸化酪氨酸底物和双磷酸化酪氨酸底物能量分解分析 见表1～3。

表1 分子动力学模拟过程中两种不同磷酸化底物与PTP1B平均总相互作用能（kJ/moL）Tab 2 The average total interaction energies between two kinds of phosphotyrosine substrates and PTP1B during the course of molecular dynamics simulation(kJ/moL)

表2 分子动力学模拟过程中两种不同磷酸化底物中各个残基与PTP1B平均静电相互作用能（kJ/moL）Tab 2 The average total electrostatic interaction energies betweenresidues in two kinds of phosphotyrosine substrates andPTP1B during the course of molecular dynamics simulation(kJ/moL)

表3 分子动力学模拟过程中两种不同磷酸化底物中各个残基与PTP1B平均范德华相互作用能（kJ/moL）Tab 3 The average total van der Wals interaction energies betweenresidues in two kinds of phosphotyrosine substrates andPTP1B during the course of molecular dynamics simulation(kJ/moL)

从表1可以看出，单磷酸化酪氨酸底物的结合能力明显低于双磷酸化酪氨酸底物，虽然单磷酸化酪氨酸底物与PTP1B的范德华相互作用较双磷酸化酪氨酸底物强，但由于单磷酸化酪氨酸底物与PTP1B的静电相互作用远弱于双磷酸化酪氨酸底物，所以，两种不同底物与PTP1B静电相互作用的差异是造成结合能力差异的重要原因。

从表2和表3可以看出，两种不同底物各个残基与PTP1B的范德华相互作用相当，但1162和1163两个残基与PTP1B之间的静电相互作用在不同底物中差异明显。单磷酸化酪氨酸底物Tyr1162和pTyr1163与PTP1B平均静电相互作用能之和远远弱于双磷酸化酪氨酸底物pTyr1162和pTyr1163与PTP1B平均静电相互作用能之和。可见，单磷酸化酪氨酸底物与双磷酸化酪氨酸底物中1163残基是否磷酸化是决定两种不同底物与PTP1B结合能力差异的主要原因。

3 讨论

由于PTP1B参与体内多条信号转导通路的调控，开发PTP1B抑制剂对于治疗糖尿病、肥胖症等多种疾病具有非常重要的意义。开发酶抑制剂最主要的研究思路就是设计酶底物的拟似物，并且设计出的酶抑制剂与酶的结合能力要和底物相当。在底物与PTP1B活性位点相互作用的过程中，Asp48在催化过程中可以与磷酸化酪氨酸底物主链形成氢键作用，从而达到固定底物，使催化过程顺利完成的目的。对于PTP1B而言，目前的研究已经发现单磷酸化酪氨酸底物和双磷酸化酪氨酸底物两种不同形式的底物，其中双磷酸化酪氨酸底物与PTP1B的结合能力要强于单磷酸化酪氨酸底物。为了进一步分析两种底物与PTP1B相互作用的差别，找到双磷酸化酪氨酸底物比单磷酸化酪氨酸底物与PTP1B亲和能力高的原因，本研究计算了分子动力学过程中底物与PTP1B的平均总相互作用能、平均静电相互作用能以及平均范德华相互作用能。因此，在研究单磷酸化酪氨酸底物和双磷酸化酪氨酸底物与PTP1B相互作用差异时，应该考虑这两种不同底物对Asp48空间构象变化的影响。设计双磷酸化酪氨酸底物拟似物的PTP1B抑制剂，可以提高抑制剂与PTP1B的结合能力，从而产生更强的抑制效果。本研究发现，双磷酸化酪氨酸底物与PTP1B的高亲和能力是由其与Asp48的氢键作用以及两个强极性双磷酸化酪氨酸残基与PTP1B之间的强静电相互作用造成的。所以，在设计PTP1B抑制剂的过程中，必须要考虑小分子结构中氢键供体或受体基团与PTP1B的Asp48之间氢键作用强弱。同时，抑制剂分子可以考虑设计成双磷酸化酪氨酸残基的拟似结构，从而达到与双磷酸化酪氨酸底物相当的酶亲和能力。

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