高蛋白酶酶活酱油发酵用米曲霉的复合诱变选育

叶 菁 蒋雪薇 罗晓明 周尚庭

扬子江2 蒋小红2 黎耀波2

(1. 长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南 长沙 410004；2. 加加食品集团股份有限公司，湖南 长沙 410600)

高蛋白酶酶活酱油发酵用米曲霉的复合诱变选育

叶 菁1蒋雪薇1罗晓明1周尚庭2

扬子江2蒋小红2黎耀波2

(1. 长沙理工大学化学与生物工程学院，湖南 长沙 410004；2. 加加食品集团股份有限公司，湖南 长沙 410600)

以市售曲精分离菌株米曲霉CS3.03为出发菌株，经UV—DES复合诱变处理，采用酪素平板法及琼脂块法进行初筛，结合Folin—酚法复筛结果对比其初筛效果，低盐固态发酵试验测试高蛋白酶酶活突变株的发酵性能，传代试验测试其遗传稳定性。结果表明：琼脂块法的初筛效率明显高于酪素平板法；对初筛菌株进行制曲复筛，获得5株有生产潜力的高蛋白酶酶活突变株，酱油发酵试验结果证明突变株氨态氮含量、全氮利用率均高于出发菌，其中突变株P7、Y5发酵制得酱油氨态氮含量分别提高14.56%，11.26%，全氮利用率分别提高3.83%，4.09%；遗传稳定性测试证明P7具有良好工业应用价值且遗传稳定性好，其蛋白酶酶活平均为4 994.18 U/g 干基，比出发菌株提高173.92%。

米曲霉；蛋白酶酶活；复合诱变；平板初筛；酱油发酵

米曲霉是酱油发酵的主要微生物，其分泌的蛋白酶能够降解原料中的蛋白质，生成氨基酸、多肽等小分子物质[1]。氨态氮含量是酱油分级的主要指标，米曲霉的酶活大小直接影响到酱油原料蛋白质的降解程度，进而影响到酱油的产量和质量，因此，米曲霉蛋白酶高产株的筛选一直是酱油发酵菌种选育的重点。早在20世纪60年代，学者[2]就以A.S.3.863为母株进行紫外诱变获得了酶活高的沪酿3.042。其后，采用物理诱变、化学诱变以及复合诱变等方式提高米曲霉的蛋白酶酶活的研究也层出不穷。邵伟等[3]通过紫外与化学复合诱变，得到一株高产蛋白酶菌株A11，其蛋白酶活由原始的3 447 U/g提高到3 668 U/g。近年来出现了一些新的菌株改造手段，如离子注入技术[4]、原生质融合技术[5]、基因调控技术[6-7]等。但离子注入技术设备昂贵、操作难度大[8]，而基因工程等分子生物学技术改造的食品用菌中存在着安全风险等问题，因此诱变选育一直是酱油用米曲霉发酵性能提升的主要方法。

育种中采用科学的筛选方法是定向高效获得高酶活突变株的关键。酱油发酵用的米曲霉突变株大多选用酪素培养基进行平板初筛，通过水解圈和菌落直径比值(K值)的大小反应蛋白酶活力的大小[9]。由于米曲霉在平板上常形成形状不规则菌落，导致利用K值筛选准确度低，误差大；此外，K值相近的菌株无法在平板初筛中判断出蛋白酶酶活的高低[10]。琼脂块法[11]可以选择厚度一致的琼脂及生长均匀的菌落打孔，减少了平板初筛中培养基用量及菌种数量的影响，可使平板初筛的结果更为接近摇瓶初筛结果，提高筛选的准确性并减少筛选的工作量。本试验以酱油曲精分离菌株为出发菌，采用紫外—硫酸二乙酯(Ultraviolet-Diethyl sulfate，UV—DES)复合诱变处理，结合Folin—酚法复筛结果，对比分析酪素平板法与琼脂块法的初筛结果，筛选出一株适用于酱油发酵米曲霉高蛋白酶酶活突变株，并应用于酱油发酵。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 菌种

米曲霉(Aspergillusoryzae)：CS3.03，长沙理工大学微生物实验从市售迪发牌酱油曲精中分离纯化并保藏。

1.1.2 培养基与筛选平板

斜面培养基：PDA(马铃薯葡萄糖琼脂)培养基[12]；

酪素培养基：干酪素4 g，磷酸二氢钾 0.36 g，硫酸锰 0.5 g，氯化锌 0.014 g，磷酸氢二钠 1.07 g，氯化钠 0.16 g，硫酸亚铁0.002 g，氯化钙 0.002 g，去氧胆酸钠1.0～2.0 g，琼脂粉15～20 g，蒸馏水1 000 mL，pH 6.5～7.0；

酪素—琼脂双层培养基：上层为酪素培养基，下层为纯琼脂培养基；

制曲培养基：豆粕 21 g，小麦6 g，麸皮3 g，水27 mL。

1.1.3 仪器

磁力搅拌器：79-2型，金坛市普瑞斯机械有限公司；

酸度计：FE28 型，瑞士梅特勒-托利多国际股份有限公司；

紫外分光光度计： Blue Star 型，北京莱伯泰科仪器股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 孢子悬液的制备 将CS3.03培养2～3 d至孢子成熟，紫外诱变时采用0.85%的无菌生理盐水洗脱，DES诱变时采用pH 7.0 0.1 mol/L 的磷酸缓冲液洗脱，再制成107CFU/mL 的孢子悬液备用。

1.2.2 UV诱变致死率曲线的测定 取10 mL孢子悬液至无菌平皿中，搅拌状态下，进行不同剂量的紫外照射，紫外照射条件：紫外灯30 W、垂直照射距离30 cm，照射时间分别为0，15，30，45，60，75，90，105，120 s。以照射时间为0 s的菌悬液为对照，按式(1)计算不同照射时间的致死率，并确定最佳诱变剂量[13]。

(1)

式中：

L——致死率，%；

n1——对照组活菌菌落形成单位，CFU/mL；

n2——处理组活菌菌落形成单位，CFU/mL。

1.2.3 DES诱变致死率曲线的测定 在250 mL的三角瓶中加入100 mL孢子悬液，取1 mL DES加至菌液中混匀，分别处理0，15，30，45，60，75，90，120 min后，取样5 mL用2.5 mL 25%的硫代硫酸钠溶液终止反应。统计致死率并确定最佳的诱变剂量。

1.2.4 初筛

(1) 酪素双层平板法：将诱变后的孢子悬液适当稀释后涂布于酪素双层平板，待平板培养好后测定各菌落的K值(透明圈直径与菌落直径比)。

(2) 琼脂块法：将经复合诱变后的孢子悬液涂布于PDA平板，上述平板用黑布包好于28℃培养48 h。挑选菌落直径较大的菌株，打孔器打下，接种于酪素—琼脂双层平板，选取透明圈较大者作为进一步筛选菌株。

1.2.5 复筛 取1 mL 106CFU/mL的初筛后菌株的孢子悬液于制曲培养基中，32℃恒温培养36 h。采用Folin—酚法[14]测定蛋白酶酶活力。

1.2.6 酱油发酵试验 按0.3%的接种量将发酵菌株接种于制曲培养基中，搅拌混匀，32℃保温发酵36 h，不定时翻曲。按成曲∶盐水为 1∶1.2(g/mL)加入16%的盐水，置于45℃保温发酵12 d，再以成曲∶盐水为1∶0.8(g/mL)添加20%的盐水，35℃后发酵10 d，发酵期间每天循环淋浇一次，发酵结束后抽提头油。氨基酸态氮和全氮测定：分别按甲醛法和凯氏定氮法执行[15]。

(2)

式中：

U——全氮利用率，%；

M1——酱油头油总质量，kg；

C1——酱油头油全氮含量，%；

M2——酱油二油及三油总质量，kg；

C2——酱油二油及三油混合物全氮含量，%；

M3——豆粕质量，kg；

C3——豆粕全氮含量，%；

M4——小麦质量，kg；

C4——小麦全氮含量，%；

M5——麸皮质量，kg；

C5——麸皮全氮含量，%。

1.2.7 遗传稳定性试验 将最终筛选所得的突变菌株进行10次试管斜面传代培养，然后制曲测其酶活，验证突变菌株的稳定性。

2 结果与讨论

2.1 出发菌株的选择及性能测定

从曲精样品中分离得到CS3.03，测定其在PDA平板上的菌落直径，琼脂块酪素-琼脂平板上的透明圈直径以及蛋白酶酶活力见表1。曲精酶活为1 254.98 U/g干基，CS3.03的蛋白酶活力比原曲精提高了45.28%，其具有较好的产蛋白酶基础，且生长良好，可以作为诱变育种出发菌株。

表1 出发菌株CS3.03性能测定Table 1 Performance measurement of the original strain CS3.03

2.2 复合诱变条件的确定

紫外(UV)诱变作为一种诱变频率高，不易回复突变的物理诱变方法，被广泛地应用于工业微生物育种[16]。DES是单功能烷化剂，具有诱变剂量易控制，对基因组损伤小，诱变效果好的优点。诱变中采用一种诱变剂处理时突变的位点比较单一，难以产生较好的突变效果。采用两种以上诱变剂复合诱变，易产生协同效应，增加突变位点，使突变效率变高，且使获得正突变株的可能性增大。试验选取UV—DES复合诱变，经测定，紫外照射时间为剂量的诱变致死率曲线见图1，1%DES对孢子悬液进行诱变处理的致死率曲线见图2。根据诱变剂致死与诱变效果双重效应，过高的致死率筛选量较少但不利于正突变，因此低于80%的致死率处理将有利于获得正突变菌株，且减少筛选量。由图1、2可知，UV照射时间为30 s，致死率为40%，DES处理30 min 时，致死率为60%。因此，选择UV对孢子悬液处理30 s后用DES处理30 min，其致死率在70%～80%，诱变效果较好且易筛选。复合诱变后平板初筛获得200株生长良好的突变株。

图1 紫外诱变致死率曲线Figure 1 Lethality of UV light mutagenesis

图2 DES诱变致死率曲线Figure 2 Lethality of DES treatment

2.3 高蛋白酶酶活突变株平板初筛

2.3.1 酪素平板法 米曲霉具有产水解蛋白酶能力，能够分解酪素培养基中的酪蛋白，从而产生出透明圈。吴华昌等[17]研究表明，采用酪蛋白透明圈法可以初步估算曲霉蛋白酶的相对酶活性高低，从而大大减少复筛的工作量。从200株突变菌中选取15株进行编号并制曲测定酶活，其结果见图3。由图3可知，酪素双层平板初筛突变菌中，Y9号菌K值最大；而制曲复筛测定蛋白酶酶活的结果中，Y5号菌的酶活最大，达到4 972.89 U/g干基，相比于出发菌提高了172.8%。从图3还可以看出，蛋白酶酶活与K值存在一定的关系，但K值大的蛋白酶酶活不一定高，如Y12的K值高于Y13，但蛋白酶酶活却低于Y13，说明K值在一定程度上可以反映蛋白酶酶活的高低，但是对于K值相近的菌株此法的准确度较低。

图3 15株突变株的K值与蛋白酶酶活对比Figure 3 Diameter ratio of clarity circle & colony and proteinase activity of 15 mutants

2.3.2 琼脂块法 由于米曲霉的生长蔓延性好，其菌落形态不规则、边缘不清晰，透明圈直径较难测定，从而导致K值(透明圈直径与菌落直径比)的测定结果准确度较低；且各菌之间的K值很小，难以反应各菌之间产酶能力的差距。为提高初筛选效率，本试验还选用了琼脂块法，将突变株涂布PDA平板培养，选择15株单个长势较好且均匀的菌落用打孔器打下，置于酪素—琼脂平板上，经一段时间的培养后直接测定其透明圈直径，同时对各突变菌进行蛋白酶酶活测定，其结果见图4。由图4可知，透明圈直径和蛋白酶酶活最大的都是P7号菌，其酶活为5 020.98 U/g干基，比出发菌提高了175.39%，也高于采用酪素双层平板法筛选出的Y5号菌。琼脂块法的初筛结果与制曲法的复筛结果一致性较好，究其原因，是由于打孔器打下的琼脂块的厚度及直径一致，因此突变菌产蛋白酶的差异可以直接从透明圈上反映出来，所以利用该法可以较为迅速且准确地筛选出高产菌。

图4 15株突变株的透明圈直径及蛋白酶酶活Figure 4 Diameter of clarity circle and proteinase activity of 15 mutants

2.4 高蛋白酶酶活突变株酱油发酵试验

从30株突变菌株中优选出5株高酶活米曲霉与出发菌株CS3.03对比进行酱油发酵试验，测定其氨态氮含量、全氮利用率，结果见表2。筛选得到的5株突变菌的蛋白酶酶活以及发酵酱油的氨态氮含量和全氮利用率都高于出发菌株CS3.03，其中突变株P7和Y5对发酵酱油品质的提升作用比较明显。相比于出发菌株，P7、Y5发酵酱油的氨态氮含量分别提高14.56%，11.26%；全氮利用率分别提高3.83%，4.09%，说明通过UV—DES诱变筛选得到的蛋白酶高产株蛋白质的利用能力具有明显增强，在酱油发酵中能够有效地提高全氮利用率。

表2 CS3.03与突变株蛋白酶酶活及发酵酱油质量对比Table 2 The comparison of proteinase activity and the quality of its fermented soy sauce between CS3.03 and the mutants

2.5 突变株遗传稳定性试验

酱油发酵试验结果表明Y5、P7具有提高出品率和产品质量的作用，将两株蛋白酶高产菌进行传代10次培养并测定其蛋白酶酶活，结果见图5。由图5可知，突变株P7平均酶活为4 994.18 U/g干基，说明突变菌株保持了较好的产酶稳定性，且蛋白酶酶活力高；Y5平均酶活为4 710.63 U/g干基，Y5传代培养中酶活较于P7酶活波动略大，由此看出，P7的遗传稳定性更佳。综合考虑蛋白酶酶活以及遗传稳定性，P7明显优于出发菌株和Y5菌株，可应用于酱油的工业化生产。

图5 Y5号菌和P7号菌的遗传稳定性Figure 5 Genetic stability of mutant Y5 and P7

3 结论

米曲霉是酱油发酵主要菌种，其蛋白酶酶活大小直接影响酱油产品质量，酱油生产中米曲霉蛋白酶酶活的保持及提升为酱油生产用菌改造的永恒主题。本试验研究证明UV—DES的理化复合诱变是比较方便有效的育种方法，初筛中采用琼脂块法可以减少酪素双层平板的工作量并提高其筛选准确性。经上述诱变及筛选方法获得了突变株P7，其蛋白酶酶活达4 994.18 U/g干基，比曲精分离的出发菌株CS3.03提高了173.92%，其发酵酱油的氨态氮含量提高14.56%，全氮利用率提高3.83%。P7遗传稳定性良好，是一株良好的酱油生产用菌。

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Multiple mutation breeding ofAspergillusoryzaewith high protease activity in soy sauce fermentation

YE Jing1JIANGXue-wei1LUOXiao-ming1ZHOUShang-ting2

YANGZi-jiang2JIANGXiao-hong2LIYao-bo2

(1.CollegeofChemical&Bioengineering,ChangshaUniversityofScience&Technology,Changsha,Hunan410004,China; 2.ChangshaJiajiaFoodCo.,Ltd,Changsha,Hunan410600,China)

The original strain ofAspergillusoryzaeCS3.03 isolated from koji powder was treated with the composite mutagen UV-DES. The mutants were screened with the method of casein plate and agar block. According to re-screening results detecting with the method of Folin-phenol, and the better screening means was found. At the same time, the fermentation ability of high protease activity mutants were tested in the state of low-salt solid-state fermentation technology, and the genetic stability of the best was tested by repeated multiplying. The results showed that the screening efficiency of agar block method was significantly higher than casein plate method. Five mutants of high protease activity with production potential were obtained by re-screening. The result of soy sauce fermentation test proved that the content of ammonia nitrogen and the utilization ratio of total nitrogen were higher than those of the original strain. The ammonia nitrogen in soy sauce fermented by mutant P7 and Y5 increased 14.56% and 11.26% respectively, and the utilization ratio of total nitrogen increased 2.92% and 3.12% in the same situation. Genetic stability test showed that P7 had great industrial application value and genetic stability, and its average protease activity was 4 994.18 U/gdb, which was 173.92% higher than that of the original bacteria.

Aspergillusoryzae; protease activity; multiple mutation; plate screening; soy sauce fermentation

长沙市科技计划重大专项、重点项目 (编号：kq1601013，K1403029-11)；湖南省水生资源食品加工工程技术研究中心开放基金项目(编号：2015GCZX07)

叶菁，女，长沙理工大学在读硕士研究生。

蒋雪薇(1972—)，女，长沙理工大学副教授，博士，硕士生导师。E-mail：jxw_72@sina.com

2016-12-24

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.01.002