超声辅助提取兔皮胶原蛋白及其理化特性

张晓洁 张宇昊 马 良 马明思 郑 红 孙 艺

(1. 西南大学食品科学学院，重庆 400715；2. 西南大学国家食品科学与工程实验教学中心，重庆 400715)

超声辅助提取兔皮胶原蛋白及其理化特性

张晓洁1张宇昊1马 良2马明思2郑 红2孙 艺2

(1. 西南大学食品科学学院，重庆 400715；2. 西南大学国家食品科学与工程实验教学中心，重庆 400715)

以兔皮为原料，研究超声波在酶法提取胶原蛋白中的应用。结果表明，超声辅助制得的胶原蛋白的提取率为(83.69±0.51)%，与传统酶法相比提高了25%。聚丙烯酰氨凝胶电泳结果表明，超声处理制得的兔皮胶原蛋白主要由α1，α2和β亚基组成，并未造成亚基的降解；紫外光谱表明，超声处理后的胶原蛋白的特征吸收波长为217 nm，说明其较好地保持了I型胶原蛋白的特征；傅立叶变换红外光谱表明，经过超声处理后的胶原蛋白分子中的氢键遭到部分破坏，但其三螺旋结构仍保持完整；差示扫描量热仪结果表明，超声法制得的兔皮胶原蛋白的热变性温度和热焓值均略低于传统兔皮胶原，相对而言仍具有较高的热稳定性。

兔皮；胶原蛋白；超声波；理化特性

胶原蛋白作为一种纤维蛋白，是细胞外基质的主要组成成分，广泛分布于结缔组织、皮肤、骨骼和韧带等部位，起着支撑器官、保护机体的功能，约占总蛋白的30%左右[1]。胶原蛋白及其水解物具有良好的乳化性、起泡性和低免疫原性，这使其在食品方面[2]、生物医学[3]和化妆品等领域有广泛的应用。

目前，胶原蛋白的提取方法主要有中性盐萃取法、酸提取法、碱提取法和酶提取法等，其中，酶法应用最为广泛，酶法提取是利用蛋白酶对胶原纤维的末端肽进行降解，使肽键断裂，再将含有三螺旋结构的主体部分溶解于稀醋酸中而被提取出来。由于酶切位点有限以及端肽中存在较强的共价交联，使得酶解效率较低，提取周期较长[4]。

超声波提取技术作为一种环境友好型新技术，因其具有提取时间短、能耗少、提取液中杂质少、对有效成分破坏较小等优点[5]，在当今的生产、生活和科学研究中被广泛使用。在超声波辅助提取过程中，快速形成的空化泡破裂时会对介质产生机械、化学和热效应作用，从而显著提高目标物质的提取效率[6-7]。近年来，对于超声辅助提取胶原蛋白方面已经有一些报道，Ran等[8]用超声辅助胃蛋白酶提取牛跟腱中胶原蛋白，酸浸泡12 h后，在超声功率750 W，频率20 kHz条件下，先超声处理18 h，再加入胃蛋白酶酶解30 h，与常规酶解48 h相比，提取率提高了154.17%。Kyung等[9]将超声用于酸法提取鲈鱼皮中的胶原蛋白，在超声功率150 W，频率20 kHz条件下，酸浸泡超声处理24 h，与传统酸法提取24 h相比，胶原蛋白的提取率提高了116.65%，但凝胶电泳结果表明，胶原发生了降解。这说明，适度超声可以提高胶原蛋白的产率，但超声处理过程中所产生的机械和热效应会导致胶原发生降解。

本研究拟以高蛋白低脂肪的兔皮为原料，考察料液比和超声时间对兔皮胶原蛋白提取率的影响，旨在提高胶原蛋白的产率，并对其理化性质进行研究，以期为其高效生产和潜在应用提供一定的理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

1.1.1 材料与试剂

兔皮：胶原蛋白含量为(13.82±0.24) g/100 g，重庆阿兴记食品有限公司，原料获取后洗净冻藏于-20℃冰箱中备用；

氢氧化钠、氢氧化钙、冰醋酸、盐酸、硫化钠、氯化钠、溴化钾、十二烷基硫酸钠：分析纯，成都市科龙化工试剂厂；

β-巯基乙醇(2-ME)、过硫酸铵(APS)、四甲基乙二胺(TEMED)：分析纯，美国BIO BASIC 公司；

Tris、考马斯亮蓝 R-250：优级纯，美国BIO BASIC 公司；

胃蛋白酶(1∶10 000)：酶活800～2 500 U/mg，北京索莱宝科技有限公司；

30%丙烯酰胺：优级纯，北京索莱宝科技有限公司；

标准蛋白：分子质量 10～200 kDa，加拿大Fermentas公司。

1.1.2 主要仪器设备

超声波细胞破碎仪：JY92-IIDN型，宁波新芝生物科技股份有限公司；

电子天平：JA3003B型，上海精天电子仪器有限公司；

料理机：FYL-C020E型，九阳股份有限公司；

实验室pH计：PE20型，上海梅特勒-托利多仪器有限公司；

大功率磁力搅拌器：99-1型，金坛市科析仪器有限公司；

台式高速离心机：5810 型，德国Eppendorf 公司；

水浴恒温振荡器：SHZ-B型，上海将任实验设备有限公司；

真空冷冻干燥机：FD-1-50型，北京博医康实验仪器有限公司；

基础电泳仪：Power PacTM型，美国Bio-Rad 公司；

凝胶成像系统：G: BOX EF 型，英国 Syn-gene 公司；

差示量热扫描仪：Pyris4000型， 美国PerkinElmer 公司；

紫外可见分光光度计：752型，上海箐华科技有限公司；

红外光谱仪：Spectrun100型，美国PerkinElmer 公司。

1.2 试验方法

1.2.1 酶法提取兔皮胶原蛋白

新鲜兔皮→预处理→去除杂蛋白(用质量浓度为10 g/L 的 NaCl 溶液处理，浸泡搅拌6 h，每2 h 换1次液)→清洗→酸浸泡(在4℃下于pH 2.2的醋酸溶液中浸泡8～10 h)→打浆→胃蛋白酶酶解(酶解液的pH 1.9，酶用量1%，酶解时间4 h)→中和、盐析(使NaCl最终浓度为4～5 mol/L，盐析12 h)→纯化(以 pH 3.0的醋酸溶液为透析液透析1 d，再以纯水为透析液透析2 d)→冻干→胶原蛋白[10]

1.2.2 超声辅助酶法提取兔皮胶原蛋白 在1.2.1的基础上稍作调整，酸浸泡打浆后先超声处理，再酶解。超声处理基本条件为：超声功率45%(总功率650 W)，频率为20 kHz，工作5 s，间隔5 s，超声时间30 min，料液比1∶15(g/mL)；重点考察料液比和超声时间对胶原蛋白提取率的影响，料液比水平设置为：1∶10，1∶15，1∶30(g/mL)，超声时间水平设置为：0，10，20，25，30，60 min。

1.2.3 胶原蛋白提取率的计算

(1)

式中：

C——胶原蛋白的提取率，%

m1——胶原蛋白的冻干重量，g；

m2——兔皮的冻干重量，g。

1.2.4 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE) 称取 2 mg 胶原蛋白溶解于 1 mL Tris—HCl(pH 8.0)溶液中[9]，使其蛋白浓度为2 mg/mL，其中分离胶和浓缩胶的浓度分别为 6%和5%，具体操作步骤参照文献[11]。染色完成并脱色后，采用 Gene Tools 数据处理软件对电泳图谱进行分析。

1.2.5 紫外光谱分析 以0.05 mol/L醋酸为溶剂，将胶原蛋白样品溶于其中，配制浓度为0.5 mg/mL的溶液，取0.05 mol/L的醋酸溶液作为空白，对样品在190～400 nm的近紫外光区进行扫描[12]。

1.2.6 红外光谱(FT-IR)分析 称取1 mg样品与150 mg溴化钾(KBr)置于玛瑙研钵中充分混匀研磨，烘干后进行压片，用傅立叶红外光谱仪在450～4 000 cm-1范围内进行测定，具体参数设置参照文献[13]。

1.2.7 热稳定性分析 准确称量样品3～5 mg，密封于铝钳锅中，在氮气环境下，以5℃/min的速率进行加热，测定温度范围为-5～200℃，记录差示量热扫描(DSC)图谱并进行分析[14]。

1.2.8 数据分析 每组试验设置3个平行，所得数据均采用origin 8.6和 SPSS 17.0软件进行分析，以平均值±标准偏差来表示。

2 结果与分析

2.1 料液比对胶原蛋白提取率的影响

由图1可知，随着超声料液比的增加，胶原蛋白的提取率先增加后降低。超声波的机械效应和空化作用有利于溶剂的渗透和扩散[15]，在料液比为1∶10(g/mL)时，溶液粘度较大，不利于超声空化作用的传导，胶原蛋白分子的溶出速率较低；随着液料比增加，当料液比为1∶15(g/mL)时，稀释作用加强，溶液的粘度和蛋白浓度都有所下降，超声波的强烈振动和空化效应增加，使得胶原纤维结构得以松散，促使分散的胶原分子溶解于稀醋酸中，因而提取率有显著提高(P<0.05)；当料液比为1∶30(g/mL)时，溶液体积的增加反而使得超声的空化作用和机械效应减弱，同样造成胶原蛋白溶出速率减慢。此外，超声作用对蛋白结构的改变会导致更多酶切位点的暴露，料液比为1∶15(g/mL)时，可能更有利于酶切位点的暴露。因此确定最佳料液比为1∶15(g/mL)，这与齐越等[16]研究结果的变化趋势相符。

图1 料液比对胶原蛋白提取率的影响Figure 1 Effects of the ratio of solid to liquid on extraction rate of collagen

2.2 超声时间对胶原蛋白提取率的影响

由图2可知，随着超声作用时间的增长，胶原蛋白提取率呈先升高后下降的趋势，在25 min时达到最大值(83.69±0.51)%，与对照组(66.66±0.72)%相比，胶原蛋白的提取率有显著提高(P<0.05)。在超声25 min以内，随着超声时间的增加胶原蛋白的提取率呈现上升趋势，这是因为超声作用使得胶原纤维结构松散，促使胶原蛋白三螺旋主体部分溶于酸中而被提取出来[17-18]；随着超声时间的进一步增加，胶原蛋白的提取率逐渐下降，可能是长时间超声处理所产生的热效应和机械效应会破坏胶原蛋白结构，使部分胶原蛋白发生变性，在酸中的溶解度降低，提取率有所下降。综上所述，确定较适超声时间为25 min，这与杨萌萌等[19]研究结果的变化趋势一致。

2.3 胶原蛋白的亚基组成

由图3可知，对照组和超声处理组提取的兔皮胶原蛋白都具有明显的α1、α2和β组分[20]。在相对分子质量120 kDa附近的两个条带分别为α1和α2链，其中α1的强度明显高于α2，说明胶原是由两条α1和一条α2肽链构成，符合I型胶原蛋白的典型特征[21]，在α2链以下未发现其它电泳条带，说明超声处理制得的兔皮胶原蛋白纯度较高，且未发生降解。SDS-PAGE 图谱和胶原蛋白亚基组成证明短时超声可以使胶原纤维底物得到松散，促使胶原分子溶于酸中，不会破坏胶原蛋白结构。

图2 超声处理时间对胶原蛋白提取率的影响Figure 2 Effects of ultrasonic time on extraction rate of collagen

M. 标准蛋白，1～6. 超声时间分别为0,10,20,25,30,60 min

2.4 胶原蛋白的紫外光谱分析

胶原蛋白的近紫外吸收光谱可用于测量它的酪氨酸含量和非螺旋端肽的完整性。Lin等[22]报道的哺乳动物或鱼类的I型胶原蛋白特征吸收光谱在218 nm处，这是由于肽键C═O的n→π*跃迁所致。图4中对照组的最大吸收峰在219 nm处，超声25 min的最大吸收峰在217 nm处，说明超声处理后的胶原蛋白较好地保持了I型胶原蛋白的特征。此外，在280 nm处有微弱吸收，这可能与胶原蛋白中酪氨酸(278 nm)，苯丙氨酸(259 nm)的存在相关，正是这些吸收峰的存在说明胶原蛋白非螺旋端肽具有完整性。

2.5 胶原蛋白的红外光谱分析

在红外光谱中，酰胺键常被作为分析和鉴定蛋白质二级结构的特征官能团[23]。通常，酰胺A带位于3 330～3 440 cm-1，主要与υN—H伸缩振动有关，由图5和表1可知，对照组和超声25 min的酰胺A带吸收特征峰分别出现在3 434.99 cm-1和3 435.45 cm-1，酰胺A带向高波数移动，说明分子中有氢键轻微破坏[24]；酰胺I带位于1 636～1 661 cm-1，与C═O的伸缩振动和υN—H弯曲有关，胶原蛋白肽链间的氢键发生变化时，可由其吸收强度和波长位置的改变反映出来，吸收峰向高波数移动表明氢键被破坏，对照组和超声25 min的酰胺I带吸收特征峰分别出现在1 654.23 cm-1和1 657.22 cm-1，表明超声处理制得的胶原蛋白分子中的氢键遭到部分破坏[23]；一般酰胺III带的存在与胶原蛋白三螺旋结构的完整性有关[25]，且其吸收峰通常位于1 220～1 320 cm-1，对照组、超声25 min的酰胺III带的吸收特征峰分别出现在1 239.66 cm-1和1 239.99 cm-1，此外，若胶原蛋白的酰胺III峰与1 453 cm-1峰面积比为1.0时，则表明其具有完整的三螺旋结构[26]，对照组和超声处理组胶原蛋白的酰胺III峰与1 453 cm-1峰面积比分别为1.063和1.042，说明经过超声处理的胶原蛋白较好地保留了三螺旋结构。

图4 超声处理25 min制得的兔皮胶原蛋白的紫外光谱分析Figure 4 UV spectra of collagen from 25 min ultrasonic treatment

图5 超声处理25 min制得的兔皮胶原蛋白的红外光谱分析Figure 5 FTIR spectra of collagen from 25 min ultrasonic treatment

表1 超声处理25 min制得的兔皮胶原蛋白红外光谱特征峰吸收波长Table 1 The absorbance positions of collagen from 25 min ultrasonic treatment

2.6 胶原蛋白的热稳定性分析

由表2可知，超声法制得的兔皮胶原蛋白的热变性温度和热焓值均略低于传统兔皮胶原。天然胶原蛋白是由三条肽链缠绕形成的一个三螺旋结构，当体系温度达到热变性温度后，分子内氢键遭到破坏，分子结构从有序螺旋态变为无序态，维系胶原纤维结构稳定的分子间作用力越大，则其变性温度和热焓值越高[27]。超声辅助提取的胶原蛋白热变性温度要稍低于对照组，可能是超声处理会使维系胶原纤维之间的氢键遭到轻微破坏，使得变性温度降低，这与红外分析中的酰胺I带结果一致。但总体来讲本试验超声条件下提取的兔皮胶原蛋白较好地保持了天然结构，热稳定性较高。

表2 超声处理25 min制得的兔皮胶原蛋白的热变性温度及热焓值表Table 2 The Tm and ΔH of collagen from 25 min ultrasonic treatment

3 结论

(1) 在超声功率45%(总功率650 W)，频率20 kHz，工作5 s间隔5 s，料液比1∶15(g/mL)，超声时间25 min条件下辅助酶法提取兔皮胶原蛋白，其提取率比相同条件下常规酶解提高了25%，提取率达(83.69±0.51)%。

(2) 聚丙烯酰氨凝胶电泳结果表明，超声处理制得的兔皮胶原蛋白主要由α1，α2和β亚基组成，为典型的I型胶原蛋白；紫外光谱表明，超声制得的胶原蛋白的特征吸收波长为217 nm，较好地保持了I型胶原蛋白的特征；傅立叶变换红外光谱表明，在本试验超声条件下，超声波的空化和机械效应等只能使部分氢键轻微破坏，对胶原蛋白保持三螺旋结构的完整性没有影响；差示扫描量热仪结果表明，与传统酶法提取的兔皮胶原蛋白相比，超声辅助提取的兔皮胶原蛋白热变性温度和热焓值略低，但总体而言仍具有较高的热稳定性。

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Ultrasonic-assisted extraction and physicochemical characteristics of collagen from rabbit-skin

ZHANG Xiao-jie1ZHANGYu-hao1MALiang2MAMing-si2ZHENGHong2SUNYi2

(1.CollegeofFoodScience,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China; 2.NationalFoodScienceandEngineeringExperimentalTeachingCenter,SouthwestUniversity,Chongqing400715,China)

The application of ultrasonic irradiation to extract pepsin-soluble collagen from the skins of rabbit was investigated in this study. The results showed that the extraction rate of collagen using the ultrasonic irradiation was (83.69±0.51) % and the yield increased by 25% in comparison with the conventional pepsin isolation method. The result of polyacrylamide gel electrophoresis confirmed that the subunits structure of collagen using the ultrasonic irradiation was mainly ofα1,α2andβ, without subunit degradation. Moreover, the ultraviolet spectrum exhibited a typical absorption peak at 217 nm, indicating that it greatly maintained the characteristics of type I collagen. Additionally, the Fourier transform infrared spectroscopy revealed that hydrogen bond was partially destroyed, but the triple helix structure of collagen remained intact even after the ultrasonic irradiation. However, the result of Scanning Differential Calorimeter analyses showed that the thermal denaturation temperature and enthalpy value of collagen using the ultrasonic irradiation were slightly lower than that of the traditional rabbit collagen, and it still had a relatively higher thermal stability.

rabbit skin; collagen; ultrasonic; physicochemical characteristic

国家自然科学基金项目(编号：31301425)；中央高校基本科研业务费重大项目(编号：XDJK2015A015)；中国博士后科学基金面上项目(编号：2014M562267)；中国博士后科学基金特别资助项目(编号：2015T80951)；重庆市基础科学与前沿技术研究重点项目(编号：cstc2015jcyjBX0116)；第四批重庆市高等学校优秀人才支持计划

张晓洁，女，西南大学在读硕士研究生。

张宇昊(1978—)，男，西南大学教授，博士。 E-mail:Zhy1203@163.com

2016—10—28

10.13652/j.issn.1003-5788.2017.01.038