一氧化氮与阿尔茨海默病发病机制及治疗的研究进展*

王家卉,陈艺璐 综述,洪芬芳,杨树龙 审校

(南昌大学医学部:1.基础医学院生理教研室；2.临床医学1203班;3.医学实验教学中心，南昌 330000)

·综 述·

一氧化氮与阿尔茨海默病发病机制及治疗的研究进展*

王家卉1,2,陈艺璐1,2综述,洪芬芳3,杨树龙1△审校

(南昌大学医学部:1.基础医学院生理教研室；2.临床医学1203班;3.医学实验教学中心，南昌 330000)

阿尔茨海默病；一氧化氮；淀粉样β蛋白；老年人

阿尔茨海默病(alzheimer′s disease,AD)是一种进行性发展的神经系统退行性疾病，以认知障碍、智力衰退和人格改变为特征。NO是神经系统中的重要信号分子，参与了AD的发病过程。NO与Aβ生成密切相关，并通过影响脑血管血流、氧化氮化应激、异常的相关信号通路以及炎症因子等影响AD发病，本文对NO参与AD的发病机制及治疗的相关研究最新进展进行了综述。

AD即老年痴呆症，是一种弥漫性中枢神经退行性疾病。AD的病因十分复杂，其发病机制尚不清楚。目前，已进入临床使用的药物和绝大部分处于研究阶段的药物都只能减缓AD发病进程，尚缺乏可完全逆转该疾病进程的药物。NO是神经系统中的重要信号分子，生理条件下由一氧化氮合酶(nitric oxide synthase,NOS) 催化生成。在病理条件下，NO通过胞内各种信号通路调节与AD发病相关的β淀粉样蛋白沉积、tau 异常磷酸化等特征性病理改变。

1 外源性和内源性NO与β淀粉样蛋白(amyloid beta protein，Aβ)

Aβ沉积形成的老年斑是AD的一个特征性病理改变。Aβ学说认为Aβ从可溶状态到不溶状态的转变是AD发病机制的关键环节，但其具体作用机制还不清楚。目前很多研究认为，NO是Aβ与AD间联系的中间环节。Aβ可以通过3种NOS影响NO的生成，其对诱生型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase，iNOS)、内皮型一氧化氮合成酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)和神经型一氧化氮合成酶(neuron nitric oxide synthase,nNOS)的作用各不相同，Aβ所诱导的NO水平升高可以促进AD的延续与发展；同时3种亚型的NOS又是Aβ活性的主要调节剂。Won等[1]报道：永久的双侧颈总动脉闭塞(bilateral common carotid artery occlusion，BCCAO)会造成学习和记忆功能下降，Aβ和血管炎症标志物增多。外源性NO供体S-亚硝基谷胱甘肽(GSNO)治疗可以提高内皮细胞和小神经胶质细胞对Aβ的摄取，抑制β-分泌酶和Aβ的分泌，从而发挥抗炎和抗淀粉样变的作用，显著提高BCCAO小鼠的学习记忆功能。Cai等[2]发现低浓度NO供体硝普钠(SNP,0.01和0.1 μmol/L)抑制淀粉样前体蛋白裂解酶1(β-site APP-clea ving enzyme 1，BACE1)的表达，从而抑制淀粉样前蛋白(amyloid precursor protein,APP)裂解并减少Aβ产生；较高浓度SNP(10和20 μmol/L)处理后BACE1表达增加，Aβ产生增加。SNP对APP加工的双向调节作用可由特定的NO清除剂c-PTIO完全阻断。因此低浓度(生理)NO抑制APP淀粉样加工，而超高浓度(病理)NO促进APP加工。这项研究为未来AD治疗提供了潜在分子靶点。

1.1 eNOS/NO途径与Aβ Aβ可通过减少NO的生物利用度促进AD的发展。在血管内皮细胞中由eNOS产生的脂溶性NO可以很快经细胞膜向下扩散进入平滑肌细胞，使其松弛，扩张血管。Aβ通过抑制eNOS依赖的NO生成使血管舒张功能失调，减少脑血流造成大脑灌注不足，导致AD患者认知降低和神经退化[3-4]。

eNOS和NO缺乏或异常会增加Aβ沉积并产生认知能力受损。在缺乏NO的体外培养人血管内皮细胞中，APP和BACE1的表达增多，导致Aβ1-40和Aβ1-42分泌增多。而在eNOS基因敲除小鼠脑微血管和脑组织内也常发生这种现象，并表现出认知能力受损。此外，先天性eNOS失活会导致小胶质细胞的活化并促进大脑的炎症反应。有研究利用eNOS缺乏的鼠模型证明了内皮源性NO的慢性丢失对AD有关病理如APP的表达和加工，Aβ生成等的促进作用。然而这不是一个传统的AD鼠模型，鼠Aβ与人Aβ对相应机体的作用不完全相同，如鼠Aβ不形成原纤维，因此高浓度的鼠Aβ并不导致鼠脑斑块的形成。未来的研究需验证在缺乏eNOS的AD鼠模型中内皮源性NO对AD病程发展的影响[5-6]。由此，内皮源性NO的保护可能是AD治疗的潜在靶点。

Wang等[7]观察到AD、高血压和大脑淀粉样血管病常常同时发生，并具有相似之处，推测脯氨酸异构酶1(Pin1)、eNOS、Aβ三者之间可能存在反馈回路：Pin1可抑制Aβ的产生并增强eNOS的活性，Aβ和eNOS可以共同抑制这一回路。Pin1和eNOS不但可以抑制Aβ的产生，还可以加速Aβ的消除，防止Aβ在微血管中沉积。另外，这两者还可以舒张血管，避免血压升高。然而这一精密的循环一旦被打破，就会导致Aβ沉积、微血管出血和血压升高，最后导致AD等。这一假说对三者的关系提出了一种新的观点：即三者之间存在分子级联关系，其预防、诊断和治疗可联合进行。这种观点有待进一步验证。

1.2 nNOS/NO途径与Aβ nNOS于神经元细胞中产生NO。Molokanova等[8]在原代培养的小鼠大脑皮层细胞中，发现Aβ1-42低聚物通过激活NMDA型谷氨酸受体(NMDAR)，使细胞内NO显著增加，且暴露于低聚Aβ后，出现突触内谷氨酸受体减少和突触外谷氨酸受体增加的现象。突触内与突触外谷氨酸受体对神经元的存活起着相反的作用，研究发现，突触外谷氨酸受体(eNMDAR)是Aβ诱导神经元释放NO的关键。eNMDAR介导的NO的增加会使动力相关蛋白1(dynamin-related protein 1,Drp1)和细胞周期蛋白依赖性激酶5(cyclin-dependent kinase 5,Cdk5)硝基化，损伤突触，造成Aβ诱导的突触损伤,导致AD患者脑中出现神经网络紊乱。因此，可减少突触损伤和神经毒性的eNMDAR拮抗剂或许对AD有治疗作用，但还需进一步研究。

1.3 iNOS/NO途径与Aβ AD的部分炎症应答是iNOS增加导致NO生成增多造成的，而Aβ可以促进iNOS表达及NO生成。小神经胶质细胞经Aβ激活后可以诱导炎症介质的合成和分泌，包括白细胞介素1β(IL-1β)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、干扰素γ(IFN-γ)、转化生长因子β(TGF-β)、生长因子、趋化因子及巨噬细胞炎性蛋白等。组织在炎症反应中诱导表达iNOS生成大量NO[9]。NO促进血管扩张充血、水肿，促进细胞毒性作用及细胞因子依赖的介质作用等炎症反应，参与诱发神经系统炎性反应及突触丢失的过程，或直接损伤神经元，最终导致神经退行性改变。Dursun等[10]发现了一种Aβ诱导产生iNOS的新机制，即维生素D-VDR(vitamin D receptor,VDR)通路破坏。他们发现，Aβ可诱导iNOS的表达，而维生素D处理后可以减轻Aβ诱导的皮层神经元的细胞毒性和抑制iNOS的表达上调。表明Aβ诱导iNOS表达是通过阻断维生素D-VDR通路介导的。维生素D可否用于AD治疗及维生素D缺乏可否看做AD的危险因素，有待证实。

同时，iNOS的表达增加和NO水平的升高又会反作用于Aβ，促进Aβ的聚集。 Kummer等[11]将鼠Aβ的酪氨酸10位点硝酸化[(3NTyr(10)-Aβ)]。发现在过度表达APP或早老素1(PS1)鼠和AD鼠大脑中，Aβ的硝化加快Aβ的聚集，并在Aβ斑块核心有硝化反应。iNOS缺乏或者口服iNOS抑制剂L-NIL会显著减少APP/PS1鼠中3NTyr(10)-Aβ和Aβ沉积，缓解意识紊乱。另外，将3NTyr(10)-Aβ注入APP/PS1小鼠的大脑中可诱发Aβ变性。表明iNOS在AD发病中具有修饰作用，是AD的一个潜在治疗靶点。Kummer等[12]研究AD中iNOS的增加对两种Aβ降解酶[胰岛素降解酶(IDE)和脑啡肽酶]活性的影响。结果发现，体外NO供体Sin-1可以抑制IDE活性，但不影响脑啡肽酶。表明iNOS上调可通过对IDE的负调控破坏Aβ的降解，促进Aβ斑块形成。因此，iNOS活性的缺失对Aβ的失活有积极作用，对AD有治疗意义。

2 NO调节脑血流改善AD症状

NO与脑血管的舒缩功能密切相关。去甲肾上腺素(NE)和乙酰胆碱(Ach)被认为分别是交感神经和副交感神经释放的具有代表性的收缩和舒张血管的物质。交感神经末梢释放的NE作用于邻近的副交感胆碱能神经突触前β2-肾上腺素能受体，促进NO释放，增强血管舒张[13]。血管内皮的紧张度与eNOS有关。eNOS生成的NO扩散至内皮下的平滑肌，激活可溶性鸟苷酸环化酶，使得cGMP含量增加，随后平滑肌松弛引起血管舒张。若局部脉管系统功能紊乱，会导致大脑灌注不足而诱发AD等疾病[14]。Tan等[15]发现局部eNOS缺乏导致年龄相关的自发性血栓性脑梗死及渐进的大脑淀粉样血管病和认知障碍，并且局部eNOS缺乏引起的脑梗死与AD的脑血流量分布模式相匹配。脑灌注不足被认定为AD临床前阶段的一个标志，是否与AD发病有因果关系尚不清楚。相对于缺血致严重低灌注，eNOS缺乏可能会导致轻微的但更多的慢性低灌注，这是AD血流障碍的新的病理生理机制。Jeynes等[16]发现，在神经纤维缠绕(neurofibrillary tangles，NFTs)和老年斑(senile plaques，SPs)存在的情况下，毛细血管中eNOS的出现与NFTs 和SPs的出现呈现明显的负相关。雷帕霉素是雷帕霉素靶蛋白(TOR)的抑制剂，可治疗AD。Lin等[17]发现改善大脑血流量(CBF)和血管密度，减少脑淀粉样血管病和微血管出血，可以提高认知功能。同Ach一样，雷帕霉素治疗可诱导大脑皮层中eNOS活化和NO释放，促进大脑血管内皮NO释放。给予NOS抑制剂(L-NG-硝基精氨酸甲酯)，可逆转雷帕霉素的血管舒张和保护作用，表明雷帕霉素通过激活NOS改善AD鼠血管密度和大脑血流量。

3 氮氧化应激是AD发生的关键步骤

Malinski等[18]认为NO能够引起氧化应激。NO能够迅速与超氧阴离子(O2-)反应生成过氧硝酸盐(ONOO-)。ONOO-是体内强氧化剂,能够氧化谷胧甘肽、蛋白硫醇等硫醇类物质；还能硝化酪氨酸残基；当二氧化碳存在时能与其反应生成NO2及CO3-,二者均为强氧化剂。NO2可与NO反应生成N2O3，从而生成S-亚硝基参与亚硝化反应。ONOO-、NO2和N2O3统称为活性氮(reactive nitrogen species，RNS),与活性氧(reactive oxygen species，ROS)产生混合效应,从而产生更为强烈的氧化氮化应激。生理情况下，活性氧自由基/活性氮自由基只有低水平的表达，调节神经营养和神经保护信号通路。然而在病理情况下，ROS/RNS的产生显著增加，细胞的抗氧化机制失衡，损害正常的神经系统功能。Drechscl等[19]认为氧化应激是神经退行性变的根源而非其次要附带现象，并提出ROS促成“年龄相关性神经退化”，即随着年龄增长，氧化损伤促进受影响大脑区域的蛋白质聚集、代谢障碍和炎症等特征性病变。氧化应激是AD的主要标志和治疗靶点。研究显示有如下几方面因素可能导致AD大脑发生氧化应激。(1)线粒体是产生ROS的关键部位，AD患者中线粒体的功能紊乱可能增加ROS的产生和氧化应激。(2)Aβ在金属离子(如Fe2+和Cu2+)存在时生成ROS。(3)在AD大脑中活化的神经胶质细胞可能分别通过NADPH氧化酶和iNOS产生过多的超氧化物和NO，增加的ROS可损害蛋白质、脂质和核酸[20]。

线粒体是ROS敏感的细胞器之一，线粒体功能退化与老龄化有关。细胞内增多的氧化剂与促氧化剂也会损伤线粒体。过量的ROS不仅影响线粒体“能量工厂”的正常功能，而且反馈性增加ROS和RNS的产生。氧化应激下，NO水平升高可导致神经元线粒体介导的细胞凋亡。细胞的自我吞噬是一种细胞内的过程，它可以消除受损的细胞器，清除细胞质中的致病性蛋白。在AD的体内和体外模型中细胞自噬有对抗细胞凋亡的保护作用，NO对自噬具有调节作用。Shariatpanahi等[21]研究发现NOS抑制剂L-NG-硝基精氨酸(L-NAME)可剂量依赖地抑制细胞凋亡，还可以激活细胞自噬，延缓AD鼠模型神经退化的过程。然而，细胞自噬的保护作用及凋亡的破坏作用可被很多因素影响，还需进一步研究(AD鼠模型中应用细胞自噬的诱导剂或抑制剂及是否应用L-NAME)证实NO信号中细胞自噬的确切作用。另外，NOS抑制剂是否可作为AD的治疗方法也有待研究。

S-亚硝基化是一种由氧化还原介导的翻译后加工，NO相关物质共价结合在靶蛋白的半胱氨酸残基上，从而形成亚硝基硫醇(SNOs)。正常情况下，蛋白质的S-亚硝基化类似于蛋白质的磷酸化，是一种细胞信号机制。但蛋白质异常的S-亚硝基化会导致蛋白质的错折叠、线粒体裂变、突触损伤和细胞凋亡等[22]。线粒体裂变蛋白1(Drp1)是一种调节线粒体裂变的GTP酶。Haun等[23]发现S-亚硝基化的DRP1的形成会导致线粒体过度裂解，伴随树突棘损伤，这标志着突触的损伤。AD大脑中S-亚硝基化DRP1水平与对照组相比有所增加，这说明S-亚硝基化DRP1的形成代表一种仅出现在神经退化时的异常信号旁路。另外，S-亚硝基化DRP1在AD患者外周血淋巴细胞也有增长。这些证据表明S-亚硝基化DRP1可以看做是AD的生物标志物。而用NOS抑制剂抑制NO生成之后，这些神经毒性事件显著减少了。因此，对S-亚硝基化DRP1合成的抑制或逆转可能成为治疗AD突触和神经元损伤的新靶点。

4 突触稳态与AD

AD鼠模型中，突触功能异常出现在认知功能障碍前，仅当突触的内环境出现改变时突触抑制增加，如抑制利阿诺定受体(RyR)介导的钙离子信号。然而，在疾病早期阶段，突触的生理表型是正常的。这表明具有代偿机制以维持正常的海马电路的输出。NO具有突触前促进囊泡释放和谷氨酸传输的作用。Chakroborty等[24]发现在早期AD中抑制NOS后导致突触抑制的增加，突触的树枝状钙离子释放(这种释放由RyR介导)减少。因此，NO在AD早期阶段具有增加突触传递性和可塑性的代偿作用。然而NO在神经保护和神经毒性中具有双面作用。N-甲基-D-天冬氨酸受体(NMDAR)是突触后的谷氨酸受体,在记忆形成中起作用。Maher等[25]发现在AD的炎症模型中NMDAR2B 亚单位过度表达，应用NOS抑制剂及iNOS抑制剂可改善行为紊乱，抑制Aβ合成及NMDAR过度生成，降低NO在大脑中的浓度。NO对突触的双重作用使AD的治疗更为复杂。

5 展 望

AD的发病机制复杂，各学说之间相互联系，至今没有定论。相应的，现有药物多是针对某一靶点，疗效并不理想。NO在AD的多种发病机制中发挥重要作用，且可作为治疗的靶点之一。然而NO与AD的关系复杂多变，在实验和临床方面均有必要进一步加强研究NO与AD之间的相关性，为开发治疗AD这一疑难病症新药提供新途径。

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10.3969/j.issn.1671-8348.2017.11.041

国家自然科学基金项目(81660751，81660151，81260504)；江西省重点研发计划项目(20161BBG70067)；江西省卫生厅科技计划项目(20132018)；南昌大学校级教学改革研究课题(NCUJGLX-14-1-111)。 作者简介：王家卉(1994-)，本科，主要从事临床医学研究。△

,E-mail:slyang@ncu.edu.cn。

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1671-8348(2017)11-1555-04

2016-11-22

2017-01-25)