蒽酮浓硫酸法测定多糖含量显色条件的研究

李雪珍，郭家文

（云南省农业科学院甘蔗研究所，开远661699）

蒽酮浓硫酸法测定多糖含量显色条件的研究

李雪珍，郭家文*

（云南省农业科学院甘蔗研究所，开远661699）

为能更好地研究甘蔗多糖，对蒽酮浓硫酸法葡萄糖标准曲线的显色条件作了系统的分析研究。研究表明：90℃恒温水浴下，10mg/L～100mg/L葡萄糖含量范围内，浓硫酸用量配比3.0mL（A）、2.8mL（B）、2.7mL（C）、2.6mL（D）、2.5mL（E）、2.4mL（F）、2.2mL（G）7个试验方案中，C、D、E三个方案较为适宜，并确定了水浴加热时间，分别在5～8min、6～10min、7～11min达到显色完全稳定。研究的过程和结果为分析测定甘蔗多糖提供了方法和基础。

多糖；吸光度；酸度；显色

多糖是多个单糖或其衍生物聚合而成的大分子化合物，聚合度大于10的糖类物质。多糖主要来自于高等植物、动物细胞和微生物细胞中，植物多糖来源于植物的根、茎、叶、皮、种子和花，多糖在调节免疫、抑制肿瘤、降血糖、抗病毒、抗衰老、抗氧化等方面具有显著活性[1]，而受关注。甘蔗作为一种高等植物，甘蔗生产中的副产物如蔗叶、蔗渣、糖蜜中含有丰富的多糖[2]。虽然蒽酮浓硫酸法测定多糖的运用较多，如海藻糖含量测定[3]、灰树花多糖测定[4]、苦瓜多糖含量测定[5]、枸杞子多糖含量测定[6]、玉竹多糖含量测定[7]等，但对不同物质的研究，显色条件如酸度、显色剂浓度、用量等[3，7]存在差异。而对标准曲线显色条件的研究，是为更好地研究甘蔗多糖提供参照。

蒽酮浓硫酸比色法的基本原理：运用葡萄糖基在浓硫酸的作用下，脱水生成的糠醛或羧甲基糠醛与蒽酮反应呈蓝绿色，在一定的浓度范围内，颜色的深浅与葡萄糖含量成正比。试验过程中基于当地海拔较高，水的沸点不到100℃，试验选择90℃水浴加热，对葡萄糖标准曲线显色反应的浓硫酸用量、显色反应时间、显色剂浓度等条件的选择[8]，分别进行分析研究。

1 材料与方法

1.1 材料

葡萄糖：分析纯；98%浓硫酸：分析纯；蒽酮：分析纯；无水葡萄糖：标准品。0.1%、0.2%、0.33%蒽酮浓硫酸显色剂：分别称取0.1、0.2、0.33g蒽酮分别溶于浓硫酸中并定容至100mL贮于棕色瓶中。40mg/L葡萄糖试液：称取0.1g葡萄糖，用水溶解并定容成100mL，再经稀释而成。1mg/mL标准葡萄糖溶液：精确称取100mg无水葡萄糖标准物质以水溶解并定容至100mL，4℃保存备用。

1.2 试验仪器

分光光度计：722S（上海精华科技有限公司），电子天平：JH3102（上海精科天美科学仪器有限公司），电子分析天平：TD—214（北京丹佛仪器有限公司），刻度吸量管：天玻A级、恒温水浴锅：HWS—12（上海一恒科学仪器有限公司），电子石英定时计：XK98—A（江苏新康医疗器械有限公司），10mL具塞比色管、超纯水系统：SMART—N（上海康雷分析仪器有限公司），冰箱：西门子KK28F1840W（博西华家用电器有限公司）。

1.3 试验方案与方法

1.3.1 试验方案按照浓硫酸用量进行单因素试验，反应液总体积5mL，葡萄糖试液与浓硫酸、显色剂配比如表1所示。实验操作按1.3.2进行，不同之处另有说明。

1.3.2 试验方法将干洁的比色管放入冰水浴中[9]，按照试验方案中各试剂的用量准确吸取试液于比色管中，然后依次加入水、浓硫酸，摇匀浸于冰水浴中冷却，最后精确加入蒽酮浓硫酸显色剂，摇匀后，轻放上比色管塞（不要拧紧），把比色管连同溶液从冰水浴中移入90℃恒温水浴中加热，同时开始计时，经过一定的加热时间后，取出比色管置于冰水浴中迅速冷却，然后在室温下平衡温度10min，立即用1cm比色皿在分光光度计上测其吸光度，以水调零，记录吸光度值，每组3个平行试验，结果取其算术平均值。

表1 试验方案

2 结果与分析

2.1 最大吸收波长的选择

在上述方案中，任选三方案如方案B、方案D、方案F，对葡萄糖试液进行试验。在水浴加热过程中观察比色管中反应物颜色的变化，当试液呈蓝绿色时，取出比色管置于冰水浴中迅速冷却，在室温下平衡10min，立即在分光光度计上测定不同波长下的吸光度值，波长-吸光度变化情况如图1所示。由图1可看出，蓝绿色物质在625nm处有最大吸收峰，故以下实验均选择625nm作为测定波长。

2.2 蒽酮显色剂浓度的选择

用一系列浓度的标准葡萄糖溶液，按照A方案分别加入0.1%、0.2%、0.33%蒽酮浓硫酸显色剂，90℃恒温水浴中准确加热7min（参照谢建华等苦瓜多糖含量测定方法的研究），以水调零，测定反应物的吸光度值，运用SPSS数据分析工具进行回归分析。并建立吸光度-浓度数学模型。模型以y表示吸光度、x表示葡萄糖浓度（mg/L），y=bx+c，模型参数如表2所示，模型调整R2＞0.995，sig均为0.000＜0.05，说明模型线性良好且有效。数学回归模型中斜率b越大，方法的灵敏度越高，常数项c是回归模型线性截距，c越大，空白值就越高，方法的最低检测限就越高。从表2可看出，3个不同浓度的蒽酮浓硫酸显色剂其b值分别为0.0086、0.0089和0.0081，说明灵敏度最高的显色剂浓度为0.2%，其次是0.33%，最小的是0.1%，而选用0.33%蒽酮浓度时空白值较高，因此以下试验在10～100mg/L的测量范围内，选用0.2%浓度的蒽酮浓硫酸显色剂。

2.3 不同浓硫酸用量方案显色时间的测定

按照表1的试验方案，加热时间每隔1到2min分别测反应物的吸光度值，分析吸光度值随加热时间的变化规律，结果如图2所示。从图2中可看出，随加热时间的延长，反应物的吸光度值逐渐升高，当加热时间延长至一定的时间后，反应物的吸光度趋于稳定，继续加热，则吸光度值开始下降。在方案A中吸光度值0.32在5min～6min趋于稳定、方案B中吸光度值0.38在5min～6min趋于稳定，随着浓硫酸用量的减少，吸光度稳定时间逐渐延长，方案C中吸光度值0.37在5min～8min之间趋于稳定；方案D中吸光度值0.36在6min～10min之间趋于稳定，方案E中吸光度0.37在7min～11min之间趋于稳定；方案F中吸光度值0.34在8min～13min之间趋于稳定；而方案G吸光度值0.28在16min～20min之间趋于稳定。各浓硫酸用量方案下显色时间可依据2.3的试验结果。

图1 出现蓝绿色物质时的吸光度波长

表2 葡萄糖吸光度-浓度模型参数

图2 各酸度方案下不同时间的吸光度

2.4 适宜的浓硫酸用量方案的选择

现配40mg/L葡萄糖试液，试验中，各方案水浴加热时间依据2.3所述，随着浓硫酸用量的增加：A＞B＞C＞D＞E＞F＞G，反应物的吸光度值为：0.32、0.36、0.37、0.37、0.37、0.35、0.30。通过EXCEL作吸光度—浓硫酸用量方案折线图，结果如图3所示。从图3中可以看出，吸光度值经历升高、平稳和降低的过程，拐点分别出现在E点和C点，可以认为在C点和E点之间显色较稳定，因此，浓硫酸用量选择C、D、E方案较为适宜。

2.5 0.2%蒽酮浓硫酸显色剂用量的选择

在C、D、E方案中，选用方案D，用新配制的同一浓度的葡萄糖试液，在总浓硫酸用量不变的情况下，显色剂分别取0、0.4、0.8、1.2、1.6、2.0mL，测定不同的显色剂用量下吸光度值的变化情况，同时以水代葡萄糖试液作空白，结果如图4所示。从图4可以看出，随着蒽酮用量的增加吸光度呈上升趋势，由于蒽酮浓硫酸显色剂本身带色，用量增加空白值升高，最低检出限也升高，取用时需要做到精确，在10～100mg/L的测量范围内，精确吸取1.0mL蒽酮浓硫酸显色剂，使吸光度值出现在0.1～1.0较为适宜的范围内。

图3 浓硫酸用量方案折线

图4 蒽酮用量吸光度

图5 葡萄糖标准曲线

2.6 葡萄糖标准曲线的绘制

将无水葡萄糖标准溶液1mg/mL分别现稀释成含量为0、20、40、60、80、100mg/L的标准使用液，采用D方案的浓硫酸用量和显色时间（6min），0.2%蒽酮浓硫酸显色剂用量1.0mL，分别测定反应物的吸光度值，标准曲线如图5所示，用SPSS数据分析工具进行回归分析，建立吸光度关于浓度的数学模型y=0.0094x+ 0.030，模型中调整相关系数R2=0.996，线性关系好，模型有效性检验sig=0.000＜0.05，模型有效。曲线斜率0.0094＞0.0089，具有较高的灵敏度，方法最低检出浓度以3倍的空白值表示为9mg/L，所以在10～100mg/L的范围内空白值低、灵敏度高，以上选择的浓硫酸用量、水浴加热时间和蒽酮浓硫酸显色剂用量条件均较适宜。

3 结论

在一定的水浴温度下，控制浓硫酸的用量和水浴加热时间即是控制反应进行的适宜程度，试验中，在90℃水浴温度下，葡萄糖的测定适宜的浓硫酸用量配比如C、D、E方案中所述，显色适宜的时间如2.3中已述。多糖是一类大分子有机物质，其组成不是均一的，研究测定甘蔗多糖时，先根据甘蔗提取的多糖进行上述试验，选择在适宜葡萄糖测定条件的基础上，与甘蔗提取的多糖相同的显色条件制作标准曲线[10]，这样才能更好地分析研究甘蔗多糖。

[1]金征宇.碳水化合物化学：原理与应用[M].北京：化学工业出版社，2007：186-188

[2]李杨瑞.现代甘蔗学[M].北京：中国农业出版社，2010：60-80

[3]李艳玲，张显忠，苗苗，等.蒽酮—硫酸法测定海藻糖含量显色条件的改进[J].食品工业科技，2009（2）296-298

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[5]谢建华，申明月，刘昕，等.苦瓜中多糖含量测定方法的研究[J].中国食品添加剂，2009（6）：209-213

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Chromogenic Condition on Determination of Polysaccharide by Anthrone-Sulfuric Acid

LI Xue-zhen,GUO Jia-wen*
(Sugarcane Research institute,Yunnan Academy of Agricultural Sciences,Kayyuan 661699)

In order to detect cane polysaccharide,the chromogenic condition of glucose standard curve by anthrone-sulfuric acid method was analyzed.The research showed that:in 90℃the constant temperature water bath,glucose was in range of 10-100 mg/L while the scope of sulfuric acid dosage ratio was in seven test scheme (A 3.0 mL,B 2.8 mL,C 2.7 mL,D 2.6 mL,E 2.5 mL,F 2,4 mL,G 2.2 mL),C,D,E was more appropriate,and heating time of the water bath were determined,respectively,in 5-8 min,6-10 min,7-11 min to achieve color completely stable.Process and results of research to provide a method for determination of polysaccharide in sugar cane.

polysaccharide;absorbance;acidity;coloration

TS244

A

1007－2624（2017）02－0015－03

10.13570/j.cnki.scc.2017.02.005

2016-10-08

2015云南省蔗糖专项：蔗糖精深加工技术的研究及功能性产品的开发；国家科技支撑计划（2012BAD14B18-04）。

李雪珍（1970-），女，工程师，从事蔗糖深加工及副产物综合利用研究。E-mail：13769406789@yeah.net

郭家文（1979-），男，研究员，从事甘蔗产业综合技术研究。E-mail：79jwguo@163.com