不同缓冲液添加大豆蛋白冷冻奶牛精子试验效果研究

许红喜，张洪涛，韩欢胜，闫德光，卫喜明，宋伟红，张金友，甘文平

（黑龙江农垦科学院畜牧兽医研究所，哈尔滨 150038）

不同缓冲液添加大豆蛋白冷冻奶牛精子试验效果研究

许红喜，张洪涛，韩欢胜，闫德光，卫喜明，宋伟红，张金友，甘文平

（黑龙江农垦科学院畜牧兽医研究所，哈尔滨 150038）

本文为解决奶牛冻精稀释液添加卵黄易污染、易将异源动物体内微生物传染给输精母畜等弊端，进行了两个方面的试验研究：（1）选择含蛋白量高的大豆粉溶液添加Tris缓冲液制成蛋白Tris稀释液，添加磷酸盐缓冲液制成蛋白PBS稀释液，及传统使用的卵黄Tris稀释液，分别冷冻奶牛鲜精，观察解冻后活力；（2）观察蛋白Tris稀释液、蛋白PBS稀释液与卵黄Tris稀释液超低温冷冻奶牛精子解冻后在4℃环境中存活时间。结果表明，蛋白Tris稀释液、蛋白PBS稀释液与卵黄Tris稀释液超低温冷冻的奶牛，细管冻精质量都能符合国家标准，但冷冻效果最佳的是蛋白Tris稀释液。在冷藏4℃下，蛋白Tris稀释液、卵黄Tris稀释液第5天精子活力仍能达到国家标准，蛋白Tris稀释液显微镜下的观察视野要比卵黄Tris稀释液清晰，不易滋长细菌。因此，添加大豆粉溶液制成的蛋白Tris稀释液冷冻奶牛精子的效果最佳，试验证明，植物源稀释液可以替代动物源稀释液。

大豆蛋白；精子活力；Tris缓冲液；磷酸盐缓冲液

Stewart 于1951年报道了用牛冷冻精液进行人工授精后顺利产下一头牛犊[1]，之后，牛冷冻精液保存技术进入快速发展时期，卵黄和奶类稀释液一直沿用至今。然而，近年来卵黄在精液保存中的使用受到了众多的质疑，卵黄对精子保护作用的机理尚不清楚，而且卵黄成分复杂不稳定，易受到外界的影响而变化，增加了精液稀释液不稳定因素[2]。卵黄来源于禽类，还可能携带病原微生物，如沙门氏菌、禽流感等，从而影响精子品质。同时近年来，由于禽流感、疯牛病等畜禽传染病的影响，精液稀释液中的动物源成分可能会造成疫情的传播、交叉感染，甚至可能产生新型疫情[3]。据Andrabi SMH的研究，卵黄中的一些氨基酸在有氧的情况下，经酶作用后，可能产生对精子有害的过氧化氢酶，该成分可抑制精子呼吸，降低精子活率[4]。世界动物健康组织（OIE)早在2003年建议，精液处理中应该避免使用有生物学感染风险的动物源产品或在处理过程中确保其生物安全性[5]。如果不能较好的解决稀释液中动物源成分添加的问题，这便使得跨地区、跨国等全球性的优秀精液流动受到了限制，影响冷冻精液的国际贸易，阻碍了全球优秀种公畜的遗传资源交流[6]。因此，寻找成分稳定、无微生物污染的非动物源性替代物显得尤为重要。

目前牛精子冷冻超低温保存的无动物源成分冷冻释液在国内还未发展成熟，各种公牛站普遍都在应用进口稀释液，张世伟2008年公布了发明专利“牛羊无动物源冻精稀释液及牛羊冷冻精液的制作方法”，公开号为CN 101310729A，此发明专利中包含牛羊无动物源性物质添加冻精稀释液配方，此配方比较繁琐，而且还有咖啡因的加入，所以未得到推广和应用。冻精生产过程中，影响冻精质量的因素很多，稀释液是其中关键性的因素[7]。郭丽娟对国外进口的浓缩稀释液和站内自制的稀释液进行了对比试验，结果表明，进口稀释液和自制稀释液对牛精液的冷冻效果差异不显著，由于进口稀释液不含卵黄等动物源物质，其视野清晰度要好于自制稀释液，也可以避免来自卵黄中有害菌污染的可能。但进口稀释液成本要远高于自制稀释液，而两种稀释液对牛精液的冷冻效果差异不大，用自制稀释液可大大降低种公牛冻精生产成本，提高种公牛站的经济效益[8]。因此研制一种冷冻效果好、视野清晰度高、无污染、配方简单、成本低的无动物源冻精稀释液对我国各大种公牛站和畜牧繁殖产业具有重大的经济价值。

1 材料与方法

1.1 冷冻精液

冷冻精液取自博瑞遗传有限公司生产基地的荷斯坦公牛，公牛编号为HB96190。

1.2 仪器

冷藏柜（海尔，青岛）、低温平衡柜（海尔，青岛）、恒温水浴箱（齐欣，上海）、液氮罐（金凤，成都）、光学显微镜（Olympus）。

1.3 大豆蛋白提取方法

取大豆去皮，75%乙醇消毒，经粉粹机破碎，研磨、溶解（用超声波破碎辅助溶解），5 000r/min离心，弃上层油脂和底层未溶解的大分子蛋白和粗纤维等，取中层溶液待用。

1.4 冷冻保存稀释液配制

蛋白Tris稀释液：三羟甲基氨基甲烷24.224g，柠檬酸13.536g，葡萄糖11g，甘油60mL，大豆溶液1 000mL。

蛋白PBS稀释液：取4.0g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4、1.8g K2HPO4、11g葡萄糖和60mL甘油，将大豆溶液定容至1 000mL，用HCl调节溶液的pH值至7.4。

卵黄Tris稀释液：三羟甲基氨基甲烷24.224g，柠檬酸13.536g，葡萄糖11g，加800mL水、200mL卵黄、60mL甘油。

1.5 不同稀释液配方冷冻奶牛精子试验方法

将采集到的精液迅速放入保温瓶内，温度保持在35℃，在实验室内做肉眼直观检查。然后取一滴精液滴在载玻片上，显微镜下观察精液精子活力，精子活力在0.6以上，分成3份分别加入少量的蛋白Tris稀释液、蛋白PBS稀释液、卵黄Tris稀释液，血球计数板检查精子密度。用3种稀释液将精液稀释至1亿个/mL，放于低温平衡柜中以0.5℃/min的速度降温。约2h后，平衡柜温度降到4℃，在4℃环境中装入0.25mL细管，将分装好的细管置于4℃平衡2～4h，在液氮面上约2.5cm、-110℃熏蒸10min，投入液氮中。按照国家标准检测细管冻精：每种稀释液配方冷冻的细管冻精随机取出10支，在37℃条件下解冻，在显微镜下观察解冻后精子活力和37℃环境下保存4h的精子活力及精子畸形率。

1.6 不同稀释液配方冷冻奶牛精子存活试验方法

将每种稀释液配方的细管冻精随机解冻10支，分别放入10支1.5mL离心管，再在离心管里添加1mL的相应配方的稀释液，记录为第1天，观察活力。然后将离心管放到4℃冷藏，每隔1d观察1次，连续观察8d。

2 试验结果

2.1 不同稀释液配方冷冻奶牛精子试验结果

按照国家标准检测细管冻精，检测结果如表1所示。从表1可以看出，解冻奶牛精子的活力、37℃环境下保存4h的精子活力、精子畸形率等关键性指标都符合国家标准，蛋白Tris稀释液、蛋白PBS稀释液、卵黄Tris稀释液都可以应用到生产实践中去，但是冷冻效果最佳的是蛋白Tris稀释液。

表1 不同稀释液的奶牛冻精质量检查结果

2.2 存活试验结果

每次在显微镜下观察10个视野取平均值，蛋白PBS稀释液在第3天出现活力下降，已达不到国家标准的输精要求。蛋白Tris稀释液和卵黄Tris稀释液在第4天出现活力下降，但至第5天仍能达到国家标准输精要求，在第6天才达不到国家标准输精要求。蛋白Tris稀释液显微镜下观察，视野比卵黄Tris稀释液清晰。

表2 冷冻奶牛精子解冻后4 ℃放置后存活活力比较

3 分析与讨论

3.1 关于不同稀释液配方冷冻奶牛精子试验结果

本试验设计为尽量减少误差，在原精活力、抽样、试验环境、稀释倍数和批次都相同的情况下，将精子密度的差异降到最低。超低温冷冻后检查精子的活力，通过显微镜进行镜检时，观察到在视野中不同配方冷冻的精子活力，其中蛋白Tris稀释液最好，其次是卵黄Tris稀释液。冷冻保护剂对精液的冷冻保存起着关键性作用，甘油作为最早应用于人类精液冷冻保存的保护剂，是一种渗透性保护剂，有利于电解质和水结合，使精子内蛋白含量稳定，减少冷冻时细胞内冰晶的形成，减少了超低温对精子的损伤，但同时也产生了一定的毒性作用，可以引起精子超微结构的明显损害。Tris缓冲液在低温下的pH值要高于室温下的，配制的蛋白Tris稀释液在室温下pH值为7，随着缓慢降温pH值缓慢升高，能减轻甘油的毒性。

3.2 关于存活试验结果

将每种稀释液配方随机解冻10支，在显微镜下观察取平均值，蛋白PBS稀释液在第3天出现活力下降，在第3天已达不到国家标准的输精要求。蛋白Tris稀释液和卵黄Tris稀释液在第4天出现活力下降，第5天仍能到达精子活力国家标准，在第6天达不到国家标准。精子只有在适宜的pH值和渗透压下才能存活，奶牛精子体外存活中，精子的pH值最适范围是在7.0～7.5之间，渗透压一般在0.295～0.310 osm为宜。3种配方稀释液的pH值和渗透压配制都满足最适要求，但是最后的冷冻活力不同，Tris缓冲液在4℃低温下的pH值要高于室温下的pH值，有利于低温精子的静息，而PBS缓冲液中含有很多盐离子，这对低温静息下的精子具有一定的损伤。

[1] Stewart D L. Storage of bull spermatozoa at low temperatures[J].Vet Rec, 1951, 63: 6566.

[2] 段洪云,张翔,孙玉玲.大豆卵磷脂对马精液冷冻保存的效果研究[J].中国畜牧兽医，2013, 08: 33-34.

[3] 金海.无动物源性水牛精液冷冻保存稀释液的研究[D]. 武汉:华中农业大学, 2014.

[4] Andrabi SMH. Factors affecting the quality of cryopreserved buffalo (Bubalus bubalis) bull spermatozoa[J]. Reprod Domest Anim, 2009, 44:552-69.

[5] 蔡虹.牛精液冷冻稀释液新配方研究[D]. 武汉:华中农业大学, 2009.

[6] Aires VA, Hinsch KD, Mueller-Schloesser F, et al. Hinsch E.In vitro and in vivo comparison of egg yolk-based and soybean lecithin-based extenders for cryopreservation of bovine semen[J].Theriogenology, 2003, 60:269-79.

[7] 王化青,邓福金. 进口稀释液与自制稀释液对比试验[J]. 现代畜牧兽医,2005, 10: 37-38.

[8] 郭丽娟,刘晓宁.两种牛冻精稀释液的对比试验[J].黑龙江动物繁殖,2004,12(5):37-38.

Study on the Effect of Different Buffer Addition of Soybean Protein on Freezing Bovine Spermatozoa

XU Hong-xi, ZHANG Hong-tao, HAN Huan-sheng, YAN De-guang, WEI Xi-ming, SONG Wei-hong, GAN Wen-ping
(Heilongjiang Agricultural Science Academy of Animal Husbandry and Veterinary Research Institute, Harbin 150038)

In this paper, in order to solve the problems that egg diluent of bovine spermatozoa frozen semen is liable to pollut by heterologous microorganisms, and infectious to insemination dams, this study includes 2 experiments(1) Tris protein dilution is made from high protein content of soybean powder solution with Tris buffer added, PBS protein dilution is made from high protein content of soybean powder solution with phosphate buffer solution, and the traditional liquid is yolk Tris diluent, they were prepared for bovine semen frozen.(2) To observe Tris protein diluent, protein PBS diluent and yolk Tris diluent cryopreservation of bovine sperm thawing in 4℃ environment preservation time. The experimental results show that Tris protein diluent, PBS protein diluent and yolk Tris diluent have no signifcant difference in liquid nitrogen of frozen bovine spermatozoa. Tris protein diluent and yolk Tris diluent can reach national standard of sperm motility for fve days in 4℃ environment preservation time. Tris protein diluent can easily distinct sperm motility and exam under microscope compared to yolk Tris diluent, it is not easily to develop bacteria. So, the effect in freezing experiment and survival time experiment of Tris protein diluent is the best, plant source dilution can substitute animal source dilution for bovine semen frozen.

Soybean protein; Sperm motility; Tris buffer solution; Phosphate buffer

S823.3

A

1004-4264（2017）03-0020-03

10.19305/j.cnki.11-3009/s.2017.03.006

2016-08-10

现代农业产业技术体系建设专项（CARS-37)。

许红喜（1979-），女，汉族，硕士，助理研究员，研究方向为畜牧兽医。

甘文平（1963-），男，汉族，研究员。