精液稀释液冷冻保护剂卵黄替代物的研究进展

潘彩霞

（中国刑事警察学院 警犬技术学院，沈阳 110000）

随着人工授精技术的产生及发展，国内外畜牧产业发展迅猛。人工授精技术可弥补本交的不足，保证大量母畜的配种需求，减少本交可能带来的疾病传播［1］，优秀种畜的遗传资源也可不受时间、空间的限制在各地流通、保存，在保护遗传资源的同时，还能加快家畜品种改良。精液保存技术是人工授精技术发展及推广的重要关卡之一。使精子在体外能存活足够长时间并保持一定的受精能力是精液保存技术的发展方向。精液冷冻保存可使精子进入休眠状态、长时间保存精子，因此近年来冷冻保存技术已成为人工授精领域学者研究的重点。

精液稀释液是影响精液冷冻保存效果的重要因素之一。精液稀释液中成分主要包括供精子生存的营养物质、保持精液酸碱稳定的缓冲物质、防止或减少降温过程中精子冰晶形成的抗冻保护剂及保护精子免受冷休克的冷冻保护剂等。目前常用的冷冻保护剂主要是卵黄，但随着对卵黄的使用和研究，人们逐渐发现其作为冷冻保护剂存在的一些弊端。卵黄作为动物性原料，可能存在病原菌，进而随着稀释液的携带进入新的传播区域。因此，卵黄的使用限制了国际间种质资源的交流。除此之外，国内外研究还发现，卵黄中一些成分对精子生存有一定负作用。M.M.Pace等［2］研究表明，卵黄中的高密度脂蛋白可诱导精子膜上的胆固醇等物质外流，使精子获能，不利于精子冷冻后长期保存。据S.M.H.Andrabi等［3］报道，卵黄中一些氨基酸经酶作用后会产生对精子有害的过氧化氢酶，该物质会抑制精子的呼吸，降低精子存活率。另外，卵黄中的成分及比例还会因所选禽类的种类及饲养环境的不同而有所差异，进而影响稀释液应用效果的稳定性［4-5］。为避免卵黄可能带来的弊端，寻求卵黄替代物已成为近年来精液稀释液研制的重点和热门。

1 低密度脂蛋白（low density lipoprotein，LDL）

LDL可从卵黄中提取，约占卵黄固体成分的三分之二，是由脂质和蛋白质形成的一种球状分子，其中的脂质主要由三磷酸甘油酯、磷脂及少量胆固醇组成。自1974年Graham等发现从卵黄中提取的LDL对精子冷冻具有保护作用以来，国内外对用LDL取代卵黄应用于精液稀释液展开了大量研究。在精子冷冻解冻过程中，LDL会黏附在精子质膜表面［6］，阻止精子质膜与精清蛋白结合导致的精子质膜中胆固醇及磷脂外流；同时LDL中的磷脂和胆固醇结合到精子质膜上，与精子质膜蛋白构成复合物，在精子表面形成一层保护膜，保证了精子质膜的完整性。另有研究表明，LDL可激活精子本身的抗氧化酶，减少精子在保存过程中所受的氧化作用，提高精子存活时间，改善精液冷冻保存效果［7］。

目前，LDL已成功应用于牛、犬、猪等动物精液稀释液中。A.S.Varela等［8］用含不同浓度LDL的稀释液（6%、8%、10%）对犬精液进行低温（5℃）及冷冻保存处理，并与20%卵黄稀释液组进行对比，结果表明，无论是5℃还是冷冻保存后，LDL稀释液组精子活力、质膜完整率都优于卵黄稀释液组（P＜0.01），且3个浓度组之间无显著差异（P＞0.05）。L.Amirat-Briand等［9］的研究表明，采用含LDL的稀释液处理精液，冷冻、解冻后进行人工授精，奶牛受胎率为59.2%，而采用含有20%卵黄的Tris稀释液，人工授精受胎率为65.3%，两者差异不显著。N.Prapaiwan等［10］用不同浓度LDL稀释液冷冻保存从犬附睾中直接提取的精子，结果表明：4%LDL稀释液组精子活力达57.69%，高于20%卵黄组（52.69%）；顶体完整性达70.54%，显著高于其他组。M.Moussa等［11］用天然提取的LDL、市面所售的冻干LDL产品及卵黄配制稀释液稀释公羊精液，经过冷冻、解冻处理后结果表明，天然LDL稀释液无论在精子活力、膜完整性等方面与卵黄稀释液均无显著差别，但冻干LDL产品制备稀释液精液品质不佳，说明市面所售LDL无法发挥对精子冷冻保护的功能。

2 牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA）

BSA是牛血清中的一种球状蛋白，是牛血清中的主要成分，可与多种阴、阳离子及小分子物质结合，在血液中起到营养、载体蛋白、pH缓冲及维持渗透压等作用［12］。在动物细胞培养中就常在细胞培养液中添加BSA，起到载体、生理和机械保护等作用。

BSA会与精子质膜中的磷脂相互作用，有效保护精子质膜，减小精液冷冻保存过程中精子的损伤程度［13］。BSA可通过吸附、清理细胞膜外的离子及小分子物质，保持精子膜内外的渗透压平衡，减小精液在稀释、冷冻过程中对精子质膜的损伤，提高精液冷冻保存效果。BSA还能作为营养物质，在保存过程中给精子提供能量［14-15］。

T.Matsuoka等［16］用含不同浓度BSA的稀释液稀释公羊精液，并与卵黄稀释液组进行对比，经冷冻解冻后对精子活力、活率及膜完整性进行检测，结果表明，用含10%、15%BSA的稀释液稀释精液，经冷冻、解冻后，精子活力分别为（55.0±2.9）%和（58.3±6.7）%，高于卵黄对照组的（41.7±4.4）%。Y.Fukui等［17］用含15%卵黄的稀释液及含10%牛BSA的稀释液稀释山羊精液，冷冻、解冻后对母羊进行人工授精，BSA组受孕率（65.5%）与卵黄组（66.7%）无显著差异，产羔率（62.1%和66.7%）也无显著差异。张志光等［18］用40 g／L BSA替代卵黄制备精液稀释液，于4℃低温保存犬精液，结果表明，精液保存8 d后精子活力为（62.5±1.5）%，质膜完整率（弯尾率）为（38.6±1.0）%，说明BSA有望作为卵黄替代物用于精液稀释液中。W.H.Lee等［19］研究发现，在稀释液中添加BSA，猪精子冷冻复苏后顶体完整性和抗氧化性都有提高。适当添加BSA可替代卵黄起到保护精子的作用，但稀释液中BSA浓度过高会吸附精子膜外离子和小分子物质，导致膜外渗透压降低，水分流入精子内，使精子膨胀、质膜破损，最终影响精子活力［16，20］。

3 大豆卵磷脂（soybean lecithin）

大豆卵磷脂是从豆油中提取的，目前市面上的大豆卵磷脂实际上是几种磷脂的混合物，其中在精液稀释液中起作用的主要是磷脂酰胆碱［21］。卵磷脂在水相中会自发形成封闭的双分子结构，是构成生物膜的主要成分［22］。大豆卵磷脂添加到精液稀释液中，其亲水基团会与精子内部水分子结合，在精子表面形成一层保护膜，降低低温对精子膜的损伤，提高质膜稳定性。大豆卵磷脂的凝固点低于缩醛磷脂，可渗透进精子细胞内，取代缩醛磷脂，故大豆卵磷脂在低温冷冻保存过程中可提高精子的抗冷打击能力，提高精子存活率。另一方面，在精液冷冻保存过程中，大豆卵磷脂所结合的不饱和脂肪酸可作为能量物质及活性物质，提高精子活力［23］。

A.T.Palasz［24］用含大豆卵磷脂的精液稀释液冷冻保存牛精液，并以卵黄稀释液作为对照组，解冻后进行人工授精，结果表明，卵磷脂组授精后受精卵发生卵裂率（44.6%）显著高于对照组（27.0%）。孟娜娜等［25］分别用含有卵黄和不同浓度大豆卵磷脂的稀释液对绵羊精液进行低温保存试验，结果表明，大豆卵磷脂的浓度为0.375%时精液保存效果最好，精子活力、顶体完整率、精子存活率等与对照组均无显著差异，表明大豆卵磷脂存在取代卵黄的可能性。G.A.Sisy等［26］分别用含有卵黄和不同浓度大豆卵磷脂的Tris稀释液对牛精液进行冷冻解冻处理，结果表明，含1%大豆卵磷脂的稀释液解冻冷冻精液后精子活力为（56%±1.00）%，高于卵黄稀释液组的（41.00±1.00）%。这说明牛精液冷冻稀释液中添加1.0%～1.5%大豆卵磷脂能替代卵黄，在冷冻解冻过程中对精子能起保护作用，且无其他有害影响。R.Masoudi等［27］采用1%大豆卵磷脂稀释液与20%卵黄稀释液稀释羊精液，经低温保存后两组精子运动特性、质膜及顶体完整率、线粒体活力均无显著差异；两组精液人工授精后，母羊受孕率、产羔率、双生率等也均无差异。

4 其他

除上述物质外，近年来学者们不断尝试用新的成分来替代卵黄作为精液稀释液中的抗冷冻剂，取得了一定成效。T.Kaewkesa等［28］用含5 mg／mL胆固醇的稀释液稀释山羊精液，与含20%卵黄的稀释液组进行比较，结果表明，两组精液品质无显著差异，经人工授精后组间受胎率也无显著差异。这说明胆固醇有望代替卵黄用于精液稀释液。A.L.P.Souza等［29］尝试用芦荟汁代替卵黄，用20%芦荟汁-Tris稀释液低温（5℃）及冷冻保存野猪精液，并以含20%卵黄的Tris稀释液作对照，结果组间精液品质无差异。

5 结语

综上，精液稀释液中添加卵磷脂、LDL、BSA等成分，能有效减少精子在冷冻过程中的损伤，保证解冻后的精子质量。卵磷脂、LDL、BSA有望替代卵黄成为冷冻保存精液时所用的冷冻保护剂，一来减少使用卵黄导致引入病原菌的可能性，二来可简化精液稀释液的配制过程，更易于实现标准化操作，提高精液稀释液的稳定性。目前，国外采用的以大豆卵磷脂及低密度脂蛋白作为原料配制的精液稀释液正逐渐取代卵黄稀释液，在一些国家已经实现商品化，而我国使用的大部分商品化精液稀释液仍依赖进口，尝试用新物质代替卵黄作为冷冻保护剂的报道也较少，任重而道远。上述卵黄替代物应用于精液稀释液中，并不断探究稀释液中各类物质的有效比例，研制适合国内畜禽的精液稀释液，是国内学者努力的方向。