香菇菌糠多糖的提取、组成及抗氧化活性分析

摘要：利用响应面法，对香菇菌糠多糖（Lentinus edodes residues polysaccharides，LRPS）的提取条件进行优化，利用高效液相色谱（HPLC）、气相色谱（GC）等对其2种组分LRPS-1、LRPS-2进行化学结构特征分析，测定其抗氧化活性。结果表明，LRPS的最佳提取条件为：加水稀释35倍、醇沉时间20 h、pH值为8，此时多糖的得率为3.69%；LRPS-1由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖组成，物质量之比为1.7 ∶[KG-*3]1.0 ∶[KG-*3]3.0，LRPS-2由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖组成，物质量之比为7.2 ∶[KG-*3]2.3 ∶[KG-*3]1.0 ∶[KG-*3]8.4；LRPS-1、LRPS-2均有较强的抗氧化活性，LRPS-2更为显著。

关键词：香菇；菌糠；响应面；提取优化；多糖；抗氧化

中图分类号：TS201.2 文献标志码： A

文章编号：1002-1302（2016）12-0325-04

收稿日期：2016-03-02

作者简介：沙日娜（1982—），女，内蒙古通辽人，硕士，讲师，主要从事农产品检验研究。E-mail：15588894651@163.com。

香菇（Lentinus edodes）别称花菇，为真菌门侧耳科香菇属世界第二大食用菌[1]。香菇口味鲜美，富含多糖、维生素、蛋白质、多元酚、朴菇素、膳食纤维等多种生物活性物质，其中，菌丝体多糖是香菇菌丝体中最重要的生物活性物质，具有抗氧化、抗衰老、抗炎、保肝护肝和降血糖等作用[2-4]。菌糠是真菌收获后的培养基剩余物，含有丰富的菌丝体，我国年产各类菌糠总量约为900万t，大部分被作为废物遗弃，在浪费资源的同时造成环境污染。响应面法（RSM）是以最经济的方式、较少的试验次数及较短的时间对参数进行全面研究，越来越多地被应用于各种生物化工处理过程[5]。本研究对香菇菌糠多糖的提取条件进行优化，利用DEAE-52纤维素柱和葡聚糖G-100对香菇菌糠多糖（LRPS）进行分离纯化，研究多糖组分LRPS-1、LRPS-2的分子量、单糖组成和抗氧化活性，从而为香菇菌糠的开发利用提供参考。

1材料与方法

1.1试验材料

香菇菌糠，由内蒙古农业科学院真菌研究所提供。

1.2仪器与试剂

1.2.1试验仪器752-N紫外可见分光光度计、DK-S24型恒温水浴锅、DZF-6021型真空干燥箱，均由上海精宏实验设备有限公司生产；GC2010气相色谱仪，日本岛津公司生产；TDL-5-A型台式离心机，上海安亭科学仪器厂生产；Nicolet380 傅立叶变换红外光谱仪，美国热电集团生产；LXJ-68-02 型离心机，北京医疗仪器修理厂生产。

1.2.2试剂30% H2O2，天津市凯通化学试剂有限公司生产；95%乙醇，天津市百世化工有限公司生产；DPPH、DEAE-52纤维素、葡聚糖G-100，Sigma公司生产；苯酚，天津市天大化学试剂厂生产；浓硫酸、浓盐酸，淄博化学试剂厂有限公司生产；三氯乙酸，天津大茂化学试剂厂生产。

1.3多糖的提取与测定

使用多功能粉碎机粉碎香菇菌糠，采用水提醇沉法[6-7]提取香菇菌糠多糖，采用苯酚-硫酸法[8]测定多糖含量。

1.4香菇菌糠多糖的提取优化

1.4.1Plackett-Burman（PB）试验设计采取9因素3水平PB试验（表1）考察各提取条件对LRPS提取率的影响；采用Design-Expert 7.0软件对数据进行分析。

1.4.2响应面（RSM）试验设计根据PB试验结果，选取pH值、加水倍数、醇沉时间这3个对多糖得率影响最大的因素进行响应面法优化条件的筛选试验，以1、0、-1编码自变量的高、中、低3个水平，通过最小二乘法拟合二次多项方程，模型表达式为：y=A0+∑Aixi+∑Aiixi+∑Aijxixj。式中，y为响应值，即LRPS得率，A0、Ai、Aii、Aij为方程系数，xi、xj（i≠j）为自变量编码值。采用Design-Expert 7.0软件对数据进行回归分析。

1.5多糖的凝胶柱层析

采用DEAE-纤维素离子交换柱对多糖进行分离纯化，采用葡聚糖G-100凝胶柱对多糖进行进一步分离纯化和纯度鉴定[9]，采用硫酸-苯酚法测定收集到的多糖溶液浓度，绘制洗脱曲线。

1.6多糖的化学结构分析

1.6.1单糖组成测定糖样品经过0.25 mol/L H2SO4 100 ℃ 加热16 h完全水解，或者不经过水解处理，按照Blakeney等的方法[10]将各单糖制备成全乙酰化糖醇衍生物；采用气相色谱分析糖的构成，分离柱为岛津公司生产的 0.25 mm×30 m毛细管柱DB-1，柱温为210 ℃，N2流速为 30 mL/min。

1.6.2多糖分子量的测定多糖样品溶于50 mmol/L的硝酸钠溶液或0.05%叠氮化钠中，获得浓度为2.0 mg/mL的糖溶液；使用0.45 μm滤膜过滤，直接进样[11]进行高效液相色谱测定，测定条件为：30 cm×4.6 mm TSKG3000PWxl色谱柱，3.5 cm×4.6 mm TSK保护柱，流动相为50 mmol/L硝酸钠溶液或0.05%的叠氮化钠，流速为0.4 mL/min，柱温为 30 ℃，进样量为20 μL。

1.7多糖抗氧化分析

多糖清除DPPH自由基的测定方法为：2 mL 95%乙醇或0.1 μmol/L DPPH，与2 mL浓度在100～1 000 mg/L之间的EPS溶液进行混合，25 ℃水浴15 min，517 nm处测定吸光度[12]。EPS清除羥基自由基的测定采用Smironff等的方法[13]，多糖还原力的测定采用Oyaizu的方法[14]。

2结果与分析

2.1PB试验

由表2可见，当香菇菌糠加水稀释20倍、pH值为5、提取温度为95 ℃、提取时间为3 h、提取1次、乙醇浓度为95%、乙醇稀释2倍、醇沉时间36 h、醇沉温度12 ℃时（编号5），LRPS的得率相对最高，为3.34%。由表3可知，试验模型的P值小于0.01，模型回归性较好，能够很好地反映变量和自变量之间的变化规律；pH值、加水倍数和醇沉时间的P值均小于0.01，这3个因素对LRPS的得率影响显著，其他因素影响相对较小或不显著。因此，选取提取pH值、加水倍数和醇沉时间这3个因素进行响应面分析试验。

2.2RSM试验

2.2.1选取优化因素pH值、加水倍数、醇沉时间分别以变量x1、x2、x3表示，经多重回归分析，LRPS得率的预测值y和变量之间的多项式模型为：

y=2.11+0.30x1+0.14x2+0.31x3-0.12x1x2-0.067x1x3+0.10x2x3-0.42x12-0.30x22-0.27x32。

2.2.2响应面数据分析由表4可知，线性回归系数x1、x3和[CM（25]二次项系数x12、x22、x32均极显著（P<0.01），线性回归系数x2显著（P<0.05），这表明pH值、加水倍数和醇沉时间对LRPS得率的影响都比较显著；模型的P值<0.000 1，具有极显著性，而F值为13.40，这说明香菇菌糠多糖的预测值和试验值一致；失拟项的F值为0.29，P值为0.128 9，这说明试验结果并非由纯误差引起，模型方程适合对LRPS提取试验的理论预测。另外，试验结果表明，模型的R2值为0.999 6，这说明试验值和预测值高度吻合，99.96%的响应值具有可变性；调整行列式系数的R2值为0.999 0，这说明 99.90% 的LRPS总变差归因于独立变量，仅约0.10%的总变量不能用模型解释。

经响应面（图1）分析，提取条件为pH值7.88、加水34.5倍、醇沉时间19.82 h，LRPS的得率相对最高，为3.85%，而验证试验LRPS的得率为3.84%，这表明该模型适用于LRPS提取。考虑到操作方便，将最优提取条件调整为pH值8、加水35倍、醇沉时间20 h，此时，LRPS的得率为3.69%。

2.3香菇菌糠多糖的组分分离纯化

采用DEAE-纤维素柱对LRPS进行组分分离，分别利用蒸馏水和0.2、0.5、1.0 mol/L NaCl溶液作为流动相对LRPS进行洗脱，得到2个组分LRPS-1、LRPS-2；对分离得到的2个组分用葡聚糖G-100凝胶作进一步分离发现，LRPS-1、LRPS-2均分离得到1个单一的洗脱峰，这表明LRPS-1、LRPS-2均为纯多糖（图2）。

2.4多糖组分化学结构分析

2.4.1单糖组成分析由表5可知，LRPS-1的单糖组成主要包括鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖，其物质量之比为 1.7 ∶[KG-*3]1.0 ∶[KG-*3]3.0；LRPS-2的单糖组成主要包括鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖，其物质量之比为7.2 ∶[KG-*3]2.3 ∶[KG-*3]1.0 ∶[KG-*3]8.4。

2.4.2分子量由表6可知，LRPS-1的数均分子量Mn为4.36×102，重均分子量Mw为2.97×104，多分散系数Mw/Mn为68.11；LRPS-2的数均分子量Mn为6.93×102，重均分子量Mw为1.18×105，多分散系数Mw/Mn为 170.27。

2.4.3多糖的抗氧化活性由图3可知，LRPS、LPS（香菇多糖）、LRPS-1、LRPS-2在波长700 nm处测得的吸光度分别为0.204±0.03、0.264±0.001、0.773±0.05、0.986±0.03；浓度为1 000 mg/L时，LRPS、LPS、LRPS-1、LRPS-2对DPPH 的清除率分别为（19.92±0.02）%、（39.88±0.01）%、（53.56±0.03）%、（55.61±0.01）%；对羟基自由基的清除率分别为（58.99±1.03）%、（66.20±1.34）%、（78.58±2.33）%、（92.10±2.57）%。由此可见，同等浓度下，LRPS的抗氧化活性略低于LPS，但是LRPS-1、LRPS-2的抗氧化活性明显高于LPS，浓度为1 000 mg/L时，LRPS-2的还原力是LPS的3.73倍，对DPPH和羟基自由基的清除率均为LPS的1.39倍。

3结论

香菇菌糠多糖的最佳提取条件：pH值为8、加水35倍、醇沉时间为20 h，此时多糖的提取率为3.69%。对LRPS进行[CM（25]分离纯化，得到LRPS-1、LRPS-2这2种组分，LRPS-1[CM）]由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖组成，物质量之比为 1.7 ∶[KG-*3]1.0 ∶[KG-*3]3.0；LRPS-2由鼠李糖、阿拉伯糖、甘露糖、葡萄糖组成，物质量之比为7.2 ∶[KG-*3]2.3 ∶[KG-*3]1.0 ∶[KG-*3]8.4。本试验选取多糖对羟基自由基清除率、DPPH清除率及还原力3个指标考察多糖体外的抗氧化活性，结果显示，LRPS-1、LRPS-2对DPPH、羟基自由基均有较强的清除能力及较强的还原力，LRPS-2的体外抗氧化活性相对更强。

[TPSRN3.tif]

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