基于LC—MS技术毛细支气管炎风热闭肺证的代谢组学研究

陈超　边逊

摘要：目的 采用高效液相色谱-质谱联用技术的代谢组学方法，探析毛细支气管炎中医风热闭肺证在血清内源性代谢物的变化，以寻找毛细支气管炎中医风热闭肺证的诊断标志物。方法 收集毛细支气管炎患儿风热闭肺证（风热闭肺组）20例和健康儿童（对照组）20例。以液相色谱-质谱联用技术对两组受试患儿的血清样本进行代谢图谱分析，并对潜在的生物标记物进行鉴定。结果 风热闭肺组与正常对照组相比很多离子峰高、峰面积均存在着明显差异，筛出具有统计学差异的差异生物标志物共8种：L-缬氨酸，尿素，L-天门冬氨酸，2氨-咪唑，D-甘露糖，L-天门冬酰胺，D-果糖，L-谷氨酰胺。结论 本研究从代谢组学小分子水平初步反映了小儿毛细支气管炎风热闭肺证的代谢特征，为从生物代谢的角度研究中医证候的现代科学内涵提供了一定的实验依据。

关键词：代谢组学；毛细支气管炎；风热闭肺证；液相色谱-质谱联用技术

Study on Metabonomics of Bronchiolitis with Wind Heat Obstructing Lung Syndrome Based on LC-MS

CHEN Chao，BIAN Xun

（Department of Pediatrics，Nanjing Traditional Chinese Medicine and Western Medicine Hospital，Nanjing University of Traditional Chinese Medicine，Nanjing 210014，Jiangsu，China）

Abstract：Objective Using high performance liquid chromatography-mass spectrometry metabonomic technique study method，the change of capillary bronchitis chinese wind heat closed the lung in serum endogenous metabolites，to find the diagnosis of bronchiolitis in Traditional Chinese Medicine of wind heat closed lungs markers.Methods Capillary bronchitis in children with wind heat closed the lung（wind heat closed lung group）and 20 healthy children（control group）20 cases.The two groups of serum sample test were analyzed by using metabolic profiling by liquid chromatography mass spectrometry，and to identify potential biomarkers.Results Many group of wind heat lung ion peak high compared with the normal control group，area there were significant differences， with statistical difference between screening biomarkers were 8： L-valine， urea， L-aspartic acid， 2 of ammonia - imidazole，D-mannose，L-asparagine，D-fructose，L-glutamine.Conclusion This study from the metabonomics small molecular level preliminary reflect the metabolic characteristics of children with bronchiolitis in wind heat closed the lung，and provide a certain experimental basis for the modern scientific connotation of TCM syndromes from the perspective of biological metabolism.

Key words：Metabonomics；Bronchiolitis；Wind heat obstructing lung syndrome；Liquid chromatography-mass spectrometry

中醫证候代谢组学研究[1]是运用代谢组学相关技术对中医不同证候患者或模型动物的血浆、尿液等样本进行代谢产物分析，得到各自的代谢产物图谱，筛查出特异性代谢产物的标志物，并用生物信息学方法分析生物标志物的功能，以确定“证相关代谢谱群”。本研究采用高效液相色谱-质谱联用代谢组学技术对毛细支气管炎风热闭肺证患儿血清内源性小分子代谢物的变化差异进行分析，探析毛细支气管炎中医风热闭肺证的代谢组学特征，以期为毛细支气管炎中医证候学研究提供代谢组学依据。

1 资料与方法

1.1一般资料 全部病例均来源于2012年2月～2014年4月我院儿科RSV毛细支气管炎风热闭肺证住院患儿，共20例。2014年3月～2015年10月健康体检患儿20例。两组在性别、年龄方面无统计学差异（P>0.05），签署知情同意书。

1.2病例纳入标准 西医诊断参照全国高等学校教材《儿科学》（第七版），中医疾病诊断、证候诊断参照普通高等教育“十五”国家级规划教材、新世纪全国高等中医药院校规划教材《中医儿科学· 肺系疾病·肺炎喘嗽》及国家技术监督局发布《中华人民共和国国家标准·中医临床诊疗术语证候部分》的相关内容。排除应激和先天性心脏病、支气管肺发育不良、早产及免疫缺陷等患儿。

1.3样本采集及处理 根据知情同意书，于患儿入院第2 d，取清晨取清晨空腹时采集静脉血5 ml，经13000 r/min离心10min。取血清，分装，先置于-20℃，1 w后置-80℃保存；标本测试时将冻存的样本在室温下解冻，取50μL置离心管中，加入150 μL乙腈，涡旋充分混匀，然后16000 r/min，高速离心5 min，取上清液过Captiva ND Lipids过滤板，取滤液进样、LC-MS仪分析。

1.4统计分析方法 在样品测定时，用Agilent MassHunter Workstation软件包中的Data Acquisition软件进行数据采集，然后用Qualitative Analysis对获得的数据进行分子特征识别，分析处理后，导入Mass Profiler Professional（MPP）软件，通过MPP软件处理数据，采用主成分分析（principal component analysis，PCA）法来描述数据内部的特征，运用PCA得分图（Score plot）获得样本分类信息，并发现可作为生物标记物的化合物，在此基础上用PLS-DA 进行建模，来考察生物标记物对于毛细支气管炎中医证候筛选的准确度和灵敏度，在多维统计中找出差异代谢物，并应用SPSS11.0统计软件进行Kruskal-Wallis检验和单因素ANOVA分析的验证，结合VIP值大于1并具有统计学意义（P<0.05）的代谢物确定为潜在标记物。

2 结果

2.1各组血浆液相色谱-质谱代谢轮廓分析 正常组、RSV感染喘息性支气管炎风热闭肺组（简称风热闭肺证组）血液液相色谱-质谱联用（LC-MS）典型总离子色谱图（Total ion current chromatogram，TIC）见图1、2，模式识别分析结果显示在相同保留时间下风热闭肺组与正常对照组相比很多离子峰高、峰面积存在着明显差异。

2.2潜在标志物 采用LC-MS仪器自带的相似匹配软件结合保留时间，通过PCA法等分析，经SIMCA-P软件分析并经过谱库鉴定、分析得出毛细支气管炎风热闭肺证患儿相比健康对照组有统计学意义的差异表达血清代谢物有8种：L-缬氨酸，尿素，L-天门冬氨酸，2氨-咪唑，D-甘露糖，L-天门冬酰胺，D-果糖，L-谷氨酰胺，见表1。

3 讨论

急性毛细支气管炎是婴幼儿时期临床最为常见的呼吸系统疾病，临床上以喘憋为特征，好发于3岁以内患儿，尤其是2月～6个月的婴儿。Sihurs等研究发现[2-3]毛细支气管炎反复发作易进展为哮喘，是儿童哮喘的风险因素之一，其确切机制目前尚不清楚。在治疗方面，现代医学尚无特效药物，中医根据辩证论治原则，组方配药，临床疗效满意，具有一定优势，但目前中医的证候学研究尚缺乏客观量化标准。

机体代谢产物的变化可敏锐地反映机体在特定生理病理状态下的变化，是组学研究的最终目标与方向，自2009年SlupskyCM[4]首次提出基于NMR的代谢组学研究方法可能适用于肺炎的病因快速诊断，在未来肺炎的医学研究中具有明显优势，本研究采用LC-MS代谢组学技术分析患儿血浆代谢物发现，毛细支气管炎风热闭肺证患儿与健康对照组间在小分子代谢物表达水平具有明显差异，共筛出具有统计学意义的差异性血清代谢物8种：L-缬氨酸，尿素，L-天门冬氨酸，2氨-咪唑，D-甘露糖，L-天门冬酰胺，D-果糖，L-谷氨酰胺。表明在RSV感染的状态下，患儿体内一些小分子代谢物的含量发生明显改变，提示该代谢通路改变具有差异性。

本研究从代谢组学小分子水平初步反映了小儿毛细支气管炎风热闭肺证的代谢特征，为从生物代谢的角度研究中医证候的现代科学内涵提供了一定的实验依据，为今后中医儿科证候学研究做出了有益探索。

参考文献：

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[6]杜丽娜.基于UPLC-MS技术的呼吸道合胞病毒肺炎痰热闭肺证代谢模式及金欣口服液干预研究[D].南京中医药大学，2015.

[7]段哲.小儿麻甘颗粒治疗风热和痰热闭肺毛细支气管炎疗效观察[D].广州中医药大学， 2013.

[8]单传松.活喘颗粒治疗小儿毛细支气管炎的临床研究[D].山东中医药大学，2012.編辑/王朵梅