miR-21、miR-27a、miR-27b的表达水平对多囊卵巢综合征患者肥胖及代谢紊乱的影响

许伟伟,许昌,谭慧芳,吕映频,祁秀娟,王秋阳,叶园英,王圆圆

(1.青岛大学医学部,山东青岛 266000；2.烟台毓璜顶医院肝胆外科，山东烟台 264000；3.青岛大学医学院附属医院生殖医学科,山东青岛 266000)

miR-21、miR-27a、miR-27b的表达水平对多囊卵巢综合征患者肥胖及代谢紊乱的影响

许伟伟1,许昌2,谭慧芳3,吕映频3,祁秀娟3,王秋阳1,叶园英1,王圆圆1

(1.青岛大学医学部,山东青岛 266000；2.烟台毓璜顶医院肝胆外科，山东烟台 264000；3.青岛大学医学院附属医院生殖医学科,山东青岛 266000)

目的 探讨多囊卵巢综合征(PCOS)患者外周血淋巴细胞miR-21、miR-27a、miR-27b的表达水平与肥胖及相关代谢紊乱的关系。方法 收集PCOS患者60例(非肥胖组22例，肥胖组38例)。电化学发光法检测其血清促卵泡素(bFSH)、促黄体生成素(bLH)、雌二醇(bE2)、孕激素(bP)、睾酮(bT)、空腹胰岛素(FINS)水平，葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖(Glu)，实时荧光定量PCR(qPCR)法检测淋巴细胞miR-21、miR-27a、miR-27b的表达水平。肥胖组控制体重后复测上述指标。结果 肥胖组bT、Glu、FINS、HOMA-IR水平均明显高于非肥胖组(P均<0.05)；肥胖组控制体重后BMI、bLH、bT、Glu、FINS、HOMA-IR水平较控制前均明显降低(P均<0.05)。肥胖组miR-21、miR-27a、miR-27b的表达水均明显高于非肥胖组(P均<0.05)，且控制体重后较控制前亦明显降低(P均<0.05)。miR-21的表达量与bT呈正相关(r=0.342,P=0.008)，miR-27a、miR-27b的表达量与FINS呈正相关(r=0.413,P=0.001；r=0.397,P=0.002)。结论 miR-21、miR-27a和miR-27b可能参与PCOS患者肥胖及相关代谢紊乱的进程。

多囊卵巢综合征;微小RNA；肥胖；实时荧光定量PCR

多囊卵巢综合征(PCOS)是一种常见的内分泌紊乱疾病，多伴有肥胖表型， 其代谢紊乱可能与脂肪沉积、高雄激素、高胰岛素等有关[1]。Murri等[2]发现miR-21、miR-27b在肥胖型与非肥胖型健康人群外周血中的表达水平存在明显差异，而在PCOS患者中未发现明显差异。miR-27a和miR-27b同属于miR-27家族，二者在肥胖型与非肥胖型PCOS患者中的表达水平是否存在差异目前尚不清楚。本研究通过检测外周血淋巴细胞miR-21、miR-27a和miR-27b在肥胖与非肥胖型PCOS患者中的表达水平，并分析控制体重对各项指标的影响，旨在探讨miR-21、miR-27a、miR-27b表达水平与PCOS肥胖及相关代谢紊乱(高雄激素、高胰岛素血症)关系。

1 材料与方法

1.1 研究对象 选取2015年8月至2016年8月于青岛大学附属医院生殖医学科就诊的PCOS患者60例，年龄27.77±2.52岁。纳入标准：(1)依据欧洲人类生殖和胚胎医学会与美国生殖医学会(ESHRE/ASRM)制定的鹿特丹诊断标准确诊为PCOS[3]。(2)近3个月内未服用糖皮质激素等激素类药物者。排除标准：(1)其他引起高雄激素疾病：库欣综合征、分泌雄激素的肿瘤、先天性肾上腺皮质增生等。(2)排卵障碍的疾病：如高泌乳素血症等。(3)其他引起肥胖的疾病或相关药物服用史者。(4)合并其他严重疾病者。根据WHO对成年人体质指数(BMI)的划分，将PCOS患者分为非肥胖组(BMI<25 kg/m2)22例和肥胖组(BMI≥25 kg/m2)38例。按照《中国居民膳食指南》指导肥胖组患者调整饮食和加强体育锻炼控制体重，其中18例患者体重呈明显下降趋势[BMI降低(2.27±0.27)kg/m2]，作为控制体重后组；余14例无明显改变，6例失访，不列入分析。本研究经医院医学伦理学委员会批准，患者均知情同意。

1.2 仪器及试剂 ABI Step One plus 定量PCR仪(美国ABI公司)，Nanodrop 2000超微量分光光度计(美国Thermo Scientific 公司)；Trizol试剂(美国Invitrogen公司)，淋巴细胞提取液(天津灏洋公司)，逆转录试剂盒、SYBR®Premix Ex TaqTMⅡ PCR试剂盒(大连宝生物公司)；全自动电化学发光免疫分析系统及其配套的试剂盒(瑞士Roche公司)。

1.3 标本采集 月经正常或稀发的PCOS患者于月经周期第3～5天,闭经者于经B超示无优势卵泡时采集空腹12 h以上的静脉血标本5 mL，3 000 r/min离心10 min，收集血清，2 h内检测各项指标。

1.4 临床相关指标的检测 采用全自动电化学发光免疫分析系统及配套试剂盒检测血清促卵泡素(bFSH)、促黄体生成素(bLH)、雌二醇(bE2)、孕激素(bP)、睾酮(bT)、空腹胰岛素水平(FINS)水平。葡萄糖氧化酶法测定葡萄糖(Glu)水平。由临床医师测量身高、体重，并根据公式BMI=体重(kg)/身高(m2)、胰岛素抵抗指数(HOMA-IR)=Glu(mmol/L)×FINS(mIU/L) /22.5计算。肥胖者控制体重3个月后复查上述指标。

1.5 RNA提取及实时荧光定量PCR检测 取各研究对象空腹静脉血4 mL，用淋巴细胞提取液提取淋巴细胞，Trizol试剂提取总RNA，用Nanodrop 2000超微量分光光度计检测总RNA 浓度和纯度，取吸光度(A260/280 nm)为1.8～2.0的样本，样本置-80 ℃冻存。用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，置-20 ℃保存。根据miR-21、miR-27a、miR-27b在miRBase中的登录号(分别为hsa-miR-21-5pMIMAT0000076、hsa-miR-27a-3pMIMAT0000084、hsa-miR-27b-3pMIMAT0000419)，由广州锐博公司设计并合成引物。按照SYBR®Premix Ex TaqTM Ⅱ PCR试剂盒说明书操作检测miR-21、miR-27a、miR-27b的表达水平。PCR总反应体系为20 μL，包括SYBR Premix Ex Taq Ⅱ(2×)10 μL，10 μmol/L上、下游引物各0.5 μL，ROX Reference Dye(50×) 0.4 μL，DNA模板2 μL，ddH2O 6.6 μL。PCR循环参数：95 ℃预变性30 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40个循环。采用Step One plus软件采集荧光信号及熔解曲线分析，以U6(试剂盒自带)为内参照。结果以2-ΔΔCt法计算。

2 结果

2.1 肥胖与非肥胖型PCOS患者临床资料的比较 2组患者年龄、bFSH、bLH、bE2、bP差异均无统计学意义(P均>0.05)；肥胖组BMI、bT、Glu、FINS、HOMA-IR及miR-21、miR-27a和miR-27b表达水均高于非肥胖组，差异有统计学意义(P均<0.05)。见表1。

2.2 肥胖型PCOS患者控制体重前后各项指标的比较 肥胖组患者控制体重后BMI、bLH、bT、Glu、FINS、HOMA-IR及miR-21、miR-27a和miR-27b的表达水平较控制体重前明显降低，差异有统计学意义(P均<0.05)。见表2。

表1 肥胖与非肥胖型PCOS患者临床资料的比较

表2 肥胖组PCOS患者控制体重前后各临床指标的比较

2.3 miRNA表达水平与bT、FINS的相关性分析 双变量相关性分析结果显示，60例PCOS患者miR-21的表达水平与bT呈弱正相关(r=0.342,P=0.008)，与FINS无明显相关关系(r=0.217,P=0.096)；miR-27a、miR-27b的表达水平与bT无明显相关关系(r=0.146,P=0.266;r=0.122,P=0.353),而与FINS呈弱正相关(r=0.413,P=0.001；r=0.397,P=0.002)。

3 讨论

PCOS通常伴有高雄激素血症、高胰岛素血症或胰岛素抵抗(IR)、肥胖等[4]。本研究发现肥胖型PCOS患者bT、Glu、FINS、HOMA-IR的表达水平均明显高于非肥胖型，而通过调整饮食和加强体育锻炼控制体重后，其bT、Glu、FINS、HOMA-IR水平较前明显降低，表明通过控制体重可以改善肥胖型PCOS患者内分泌紊乱。此外，本研究还发现，肥胖组和非肥胖组bLH水平差异无统计学意义(P>0.05)，但控制体重后bLH表达水平可明显降低，与彭真等[5]的研究结果一致。故而推测控制体重可以降低PCOS肥胖患者自身的bLH水平。

另有研究[6-7]表明， miR-21、miR-27a、miR-27b在糖脂代谢过程中发挥重要作用。Murri等[2]研究结果表明，miR-21、miR-27b在PCOS肥胖组与非肥胖组间差异无统计学意义。而本研究发现PCOS肥胖者miR-21、miR-27a、miR-27b的表达水平较非肥胖者明显增加，结果不一致的原因可能与研究人群存在种族、地域差异性，PCOS的异质性以及样本量的多少有关。此外，本研究还发现PCOS肥胖者控制体重后其外周血淋巴细胞miR-21、miR-27a、miR-27b的表达量降低，进一步证实了miR-21、miR-27a、miR-27b可能参与了PCOS肥胖的进展。

由于高雄激素、高胰岛素血症是PCOS的主要病理生理学基础，且肥胖和高雄激素血症、高胰岛素血症等病理生理学异常相互作用, 互为因果。本研究发现与非肥胖组相比，PCOS肥胖患者miR-21、miR-27a、miR-27b的表达水平较高。进一步比较miR-21、miR-27a、miR-27b与bT、FINS的相关性，结果显示miR-21的表达与bT呈正相关，与FINS无明显相关；而miR-27a、miR-27b的表达与FINS呈正相关，与bT无明显相关，但三者的相关性均较弱，推测miR-21、miR-27a、miR-27b可能参与了PCOS肥胖及相关代谢紊乱(高雄激素血症、高胰岛素血症)的进程，但具体的作用机制仍需进一步研究证实。本研究还存在一些不足之处，如仅比较了肥胖型和非肥胖型PCOS患者的各项指标，但是未能进一步纳入健康人群作为对照，且样本例数仍显不足使统计结果可能存在误差。此外,本研究并未涉及miR-21、miR-27a、miR-27b在PCOS患者中调控的具体下游靶基因及作用途径，今后我们将进一步进行相关机制研究。

[1]Tosi F, Di Sarra D, Kaufman JM,etal. Total body fat and central fat mass independently predict insulin resistance but not hyperandrogenemia in women with polycystic ovary syndrome[J]. J Clin Endocrinol Metab, 2015, 100(2):661-669.

[2]Murri M, Insenser M, Fernández-Durán E,etal. Effects of polycystic ovary syndrome(PCOS), sex hormones, and obesity on circulating miRNA-21, miRNA-27b, miRNA-103, and miRNA-155 expression[J]. J Clin Endocrino Metab, 2013, 98(11):1835-1844.

[3]Rotterdam ESHRE/ASRM-Sponsored PCOS consensus workshop group. Revised 2003 consensus on diagnostic criteria and long-term health risks related to polycystic ovary syndrome(PCOS)[J]. Hum Reprod, 2004,19(1):41-47.

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[6]俞静. 内脏脂肪棕色化功能改变影响肥胖的分子机制研究[D].南京：南京医科大学,2013.

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(本文编辑：许晓蒙)

10.13602/j.cnki.jcls.2017.03.10

许伟伟，1990年生，女，硕士研究生，主要从事临床妇产科研究。

祁秀娟，教授，硕士研究生导师，E-mail:allseasons@yeah.com。

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2017-01-09)