不同孔径微孔滤膜对肿瘤细胞滤过的影响*

刘文娟,巩萌,崔宁轩,王颖,赵霄,余春红,易宗春

(北京航空航天大学生物与医学工程学院，北京 100191)

·调查研究·

不同孔径微孔滤膜对肿瘤细胞滤过的影响*

刘文娟,巩萌,崔宁轩,王颖,赵霄,余春红,易宗春

(北京航空航天大学生物与医学工程学院，北京 100191)

目的 探讨不同孔径微孔滤膜对不同直径大小的肿瘤细胞的滤过作用及其对过滤后细胞活性的影响。方法 选择不同孔径(1、3、5、8、10 μm)的聚碳酸酯微孔滤膜分别过滤浓度相同但细胞直径不同的Jurkat、K562和A549细胞，测定细胞通过滤膜的滤过率；光学显微镜测量3种细胞(包括甲醛固定后的K562)的直径及其经不同孔径的滤膜过滤后的细胞直径；台盼蓝染色法检测经滤膜过滤后的K562细胞活性，对细胞进行再培养，并用生长曲线分析其细胞增殖能力。结果 Jurkat、K562和A549细胞均不能通过1 μm孔径的滤膜，通过3、5、8、10 μm孔径滤膜的滤过率均依次升高。经3 μm孔径滤膜滤过的K562细胞存活率为92.0%，且滤过后的细胞再培养后的细胞增殖能力仍较强。经甲醛固定的K562细胞的滤过率明显降低，且细胞平均直径无明显变化。结论 活细胞能穿过孔径小于其直径的滤膜；穿过滤膜的细胞仍保持活性增殖，但甲醛固定可明显减少细胞通过滤膜。

聚碳酸酯微孔滤膜;滤膜孔径；细胞直径;滤过率

肿瘤细胞从原发组织部位脱落，穿过血管壁进入血液循环形成循环肿瘤细胞(circulating tumor cells, CTCs)[1]，但实体肿瘤患者外周血中CTCs含量极少，而从血细胞中富集和分离CTCs是检测外周血CTCs的前提。目前，CTC富集和检测新方法不断涌现，已经文献证实的可达数十种[2]，但由于CTCs含量非常少以及缺乏有效的特异性标志物，现有的富集方法主要基于CTCs物理性质或免疫磁性。然而，梯度密度离心法敏感性低，免疫磁性分离法会造成假阴性结果，微流控芯片技术成本高，均不利于临床检测。使用膜过滤法富集 CTCs操作简便，成本低，且敏感性较高。多数上皮来源的CTCs直径为14～26 μm不等，但有些类型肿瘤细胞较小，如小细胞肺癌细胞直径只有7～10 μm[3]。血细胞相对于肿瘤细胞有较大的变形能力，从而能穿过孔径小于其细胞直径的微孔滤膜，如多数红细胞可以穿过孔径较小的滤膜[4]。但肿瘤细胞是否具有变形能力，从而穿过孔径小于其直径的微孔滤膜目前国内外报道少见。本研究旨在分析不同直径肿瘤细胞通过微孔滤膜的滤过作用，以及过滤后细胞的直径和活性变化。报道如下。

1 材料与方法

1.1 细胞系、试剂及仪器 K562、A549和Jurkat细胞(中国医学科学院基础医学研究所细胞中心)；可换膜式过滤器、12孔细胞培养板(北京凯乐思公司)；不同孔径(1、3、5、8和10 μm)规格聚碳酸酯微孔滤膜(北京升河滤膜公司)；10 mL注射器(上海治宇公司)；IX73荧光显微镜(日本Olympus公司)；DT5-1离心机(北京时代北利离心机公司)；RPMI 1640培养基(美国Invitrogen公司)；胎牛血清(FBS，天津灏洋公司)；4%多聚甲醛(北京索莱宝公司)；4%台盼蓝溶液(北京鼎国昌盛公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 K562、A549和Jurkat细胞用含10% FBS的RPMI 1640培养基于37 ℃、5% CO2培养箱中培养。PBS调节细胞浓度至(7.2～7.4)×105/mL，用于后续实验。

1.2.2 甲醛固定及台盼蓝染色 收集处于对数生长期的K562细胞，89×g离心5 min，弃上清，PBS洗涤，89×g离心5 min，重复3次，加入4%多聚甲醛固定15 min，PBS洗涤，89×g离心5 min，重复3次，用0.4%台盼蓝溶液染色5 min，PBS洗涤，并用PBS调节细胞浓度至(7.2～7.4)×105/mL，用于后续实验。

1.2.3 细胞直径与滤过率的测定 将K562、A549和Jurkat活细胞及甲醛固定后的K562细胞的细胞浓度调至(7.2～7.4)×105/mL。分别取200 μL细胞悬液，用1、3、5、8和10 μm孔径滤膜滤器过滤，并用800 μL RPMI 1640培养基冲洗过滤装置，滤过的液体收集于EP管，用血球计数板进行细胞计数，实验重复3次。细胞直径及其滤后的细胞直径用光学显微镜拍照，利用Image J图像处理软件根据标尺的大小测量；细胞经滤膜滤过的滤过率计算公式：滤过率(%)=100%×滤过的液体中细胞数/滤过前的细胞数。

1.2.4 过滤后K562细胞活性与再培养 收集对数生长期的K562细胞，用RPMI 1640培养基调节细胞浓度至(7.2～7.4)×105/mL。(1)检测过滤后细胞的活性：取200 μL细胞悬液,经不同孔径(1、3、5、8和10 μm)滤膜滤器过滤，并用800 μL培养基冲洗过滤装置，收集滤过的液体，加入0.4%台盼蓝染色液染色3 min，计算细胞存活率，以不经膜过滤的K562细胞进行同样的处理作为对照组。实验重复3次。细胞存活率计算公式：存活率(%)=100%×活细胞总数/细胞总数。(2)细胞再培养：分别取上述过滤后的液体接种至12孔细胞培养板，置于37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养24 h,用光学显微镜观察并拍照(1、3 μm孔径的滤膜滤过后的细胞数量极少，培养3 d后再拍照)；(3)绘制生长曲线：细胞经1、3、5、8和10 μm孔径的滤膜多次过滤，将过滤后的细胞浓度调至2×105/mL并分别接种于12孔细胞培养板，使每孔细胞浓度为5×105/mL，以不过滤的K562细胞作为对照组调至相同浓度，置于37 ℃、5% CO2培养箱中常规培养8 d，每天用细胞计数板记录每孔的细胞浓度。每种孔径设3个复孔，绘制经各孔径过滤后的细胞生长曲线。

1.3 统计学分析 用Excel 2010软件进行。多组间比较用方差分析，组间两两比较用LSD-t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。微孔滤膜的实孔径大小与细胞滤过率的关系、细胞直径大小与细胞滤过率的关系通过绘制散点图，用Pearson相关进行分析。

2 结果

2.1 细胞直径与滤过率 Jurkat、K562、A549的细胞直径分别为(11.57±1.25) μm、(13.76±1.71) μm和(17.79±3.90) μm。与滤前细胞直径比较，获得K562滤过后细胞直径差异有统计学意义(P<0.05)，而固定的K562细胞差异无统计学意义。见表1。用不同规格滤膜过滤K562、Jurkat和A549细胞时，3者均不能穿过1 μm孔径；且通过3、5、8、10 μm孔径滤膜的滤过率均依次升高，差异有统计学意义(P均<0.01)。同时，甲醛固定染色后的K562细胞与活的K562细胞相比，直径减小，滤过率明显降低(P<0.01)，不能穿过孔径为1 μm和3 μm的滤膜，且5 μm滤膜对其的滤过作用明显降低。见表2。

表1 K562细胞经不同滤膜过滤后的细胞直径(μm)

注：与过滤前比较，*，P<0.05；与活细胞比较，#，P<0.05；-，无数据。

表2 不同孔径滤膜对各细胞的滤过率(%)

注： 与10 μm的滤过率比较， *，P<0.01；与固定的K562细胞比较，#，P<0.01 。

2.2 相关性分析

2.2.1 滤膜孔径与滤过率的相关性 将滤膜孔径(X)与滤过率(Y)进行相关性分析(1 μm规格滤膜不参与分析)，结果发现滤膜孔径对Jurkat、活K562、A549、固定K562细胞的滤过率均呈正相关，相关系数(r)分别为0.963，0.943，0.971，0.912，P均<0.01。见图1。

图1 微孔滤膜的孔径与细胞滤过率的关系

2.2.2 细胞直径与滤过率的相关性 3、5、8、10 μm孔径滤膜的滤过率分别与K562细胞直径呈明显负相关，相关系数(r)分别为-0.915，-0.919，-0.926和-0.885，P均<0.01。见图2。

2.3 过滤后K562细胞的活性分析

2.3.1 细胞存活率 经3、5、8和10 μm孔径滤膜滤过的K562细胞的存活率分别为(92.0 ±2.0)%、(99.2 ±0.5)%、(99.3 ±0.3)%、(99.7±0.2)%，未滤过对照组细胞的活性率为(99.7±0.4)%。除3 μm (P<0.01)孔径的滤膜过滤对细胞有一定损伤外，更大孔径滤膜过滤对细胞基本没有损伤(P>0.05)。

图2 细胞直径与细胞滤过率的关系

2.3.2 生长曲线分析 结果表明，经相同浓度接种过滤后的细胞培养8 d后，过滤后细胞的生长曲线与对照组间无明显差异(F=2.61，P>0.05)。见图3。

图3 过滤后K562细胞的生长曲线

3 讨论

本实验在使用不同孔径的微孔滤膜对细胞悬液进行过滤的分析时发现，1 μm孔径不能过滤K562、Jurkat和A549细胞，3 μm孔径的微孔滤膜对3种细胞均呈不同程度的滤过，但滤过率均在2.5%以内，5 μm孔径的微孔滤膜对3种细胞的滤过率增加了10倍以上，表明直径大于滤膜孔径的细胞仍能穿过滤膜。另有研究证实，直径为5～9 μm的红细胞可以100%穿过3.3 μm孔径的滤膜[4]；Coumans等[5]研究也发现，直径15 μm的MDA-231细胞可穿过孔径为5 μm的滤膜微孔；因此，不是所有小于肿瘤细胞直径的孔径滤膜，都能有效分离和富集；利用滤膜过滤细胞悬液时，细胞的滤过是影响富集细胞存留于滤膜上(回收率)的主要因素。随着细胞直径越大，过滤回收率越大；适度减小滤膜孔径会提高回收率[6]。Hosokawwa等[7]利用孔径8～9 μm的微腔阵列过滤混入血液的NCI-H69、NCI-H82、DMS79、A549、NCI-H358、PC-14、HCC827和NCI-H441细胞的回收率依次为68%、80%、76%、98%、100%、97%、99%和98%[7]。目前普遍采用8 μm孔径的微孔过滤对直径较大的肿瘤细胞有较好的富集效果，但对直径较小的肿瘤细胞富集作用有限。

本试验中的台盼蓝染色结果表明，滤过后的细胞活性相对于对照组并未出现明显降低(3 μm除外)；将滤过的细胞继续培养一段时间后，镜下观察及生长曲线证明经各孔径(3、5、8和10 μm)过滤后的细胞仍能正常生长增殖。较高的变形能力是肿瘤细胞“挤过”滤膜的微孔重要原因。而变形能力与细胞自身的骨架结构变化、细胞膜的粘弹性和细胞内液的黏度等因素密切相关。例如，直径15 μm的MDA-231可轻松穿过孔径为5 μm的滤膜微孔，而直径为6 μm的聚苯乙烯球由于具有很大的刚性就不能穿过[5]。本研究发现，固定染色后的K562细胞直径减小，但滤过率降低，不能穿过孔径为1 μm和3 μm的滤膜，5 μm的滤膜对细胞的滤过作用明显降低。表明固定染色可能使其变形能力降低，从而降低了过滤率。

综上所述，肿瘤细胞能穿过孔径小于其直径的滤膜，穿过滤膜的细胞仍保持生长增殖活性，但甲醛固定可显著减少细胞通过滤膜，利用过滤方法富集肿瘤细胞需要考虑到这一点以保证足够高的回收率。

[1]Pantel K, Speicher MR. The biology of circulating tumor cells[J]. Oncogene, 2016, 35(10): 1216-1224.

[2]Gabriel MT, Calleja LR, Chalopin A,etal. Circulating tumor cells: A review of non-EpCAM-based approaches for cell enrichment and isolation[J]. Clin Chem, 2016, 62(4): 571-581.

[3]Ilie M, Hofman V, Long E,etal. Current challenges for detection of circulating tumor cells and cell-free circulating nucleic acids, and their characterization in non-small cell lung carcinoma patients. What is the best blood substrate for personalized medicine?[J]. Ann Transl Med, 2014, 2(11):107.

[4]Henon Y, Sheard G, Fouras A. Erythrocyte deformation in a microfluidic cross-slot channel[J]. Rsc Advances, 2014, 4(68):36079-36088.

[5]Coumans FA, van Dalum G, Beck M,etal. Filtration parameters influencing circulating tumor cell enrichment from whole blood[J]. PLoS One, 2013, 8(4): e61774.

[6]Coumans FA, van Dalum G, Beck M,etal. Filter characteristics influencing circulating tumor cell enrichment from whole blood[J]. PLoS One, 2013, 8(4): e61770.

[7]Hosokawa M, Kenmotsu H, Koh Y,etal. Size-based isolation of circulating tumor cells in lung cancer patients using a microcavity array system[J]. PLoS One, 2013, 8(6): e67466.

(本文编辑：许晓蒙)

Effects of microporous membranes with different pore sizes on the filtration of tumor cells

LIUWen-juan,GONGMeng,CUINing-xuan,WANGYing,ZHAOXiao,YUChun-hong,YIZong-chun

(SchoolofBiologicalScienceandMedicalEngineering,BeihangUniversity,Beijing100191,China)

Objective To investigate the filtration roles of microporous membranes with different pore sizes in the tumor cells with different diameters, and effects on the filtered cells. Methods Three kinds of tumor cells with different cell diameters and same concentrations, including Jurkat, K562 and A549, were filtered by the polycarbonate microporous membranes with different pore sizes such as 1, 3, 5, 8 and 10 μm, respectively, and their filtration rates were determined. The diameters of three kinds of tumor cells before and after filtration, and the fixed K562 cells with formaldehyde, were measured by an optical microscope. The activity of the filtered K562 cells were detected by the trypan blue staining. After the filtered K562 cells were re-cultured, their proliferation activity was analyzed by the growth curve. Results Jurkat, K562 and A549 cells couldn′t pass the filter membrane with 1 μm of pore size. The filtration rates of three kinds of tumor cells passing the fliter membranes with 3 μm, 5 μm, 8 μm and 10 μm of pore sizes increased in turn. The survival rate of K562 cells filtered by 3 μm of pore size of membrane was 92.0%, and the proliferation acticity of re-cultured K562 cells was still strong. The filtration rate of the fixed K562 cells with formaldehyde was significantly decreased, and the average diameter of the filtered cells had no obvious change. Conclusion The living cells are able to pass the membranes with the pore sizes less than their diameters. The living cells passed the filter membranes may still maintain their growth and proliferation activity. However, the fixation of formaldehyde may significantly reduce the number of cells passed the membrane.

polycarbonate microporous membrane; pore size of membrane; cell diameter; filtration rate

10.13602/j.cnki.jcls.2017.03.20

国家自然科学基金(81573192，81072325)。

刘文娟，1992年生，女，硕士研究生，从事外周血循环肿瘤细胞检测技术研究。

易宗春，副教授，硕士研究生导师，博士，E-mail:yizc@buaa.edu.cn。

R73

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2016-11-05)