菌株Sr18杀线虫代谢物的规模发酵及杀线效果研究

王亚萍，王修清，孙建华，2，冯欣，2，孟庆恒，2*

（1.天津师范大学生命科学学院，天津300387；2.天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）

菌株Sr18杀线虫代谢物的规模发酵及杀线效果研究

王亚萍1，王修清1，孙建华1，2，冯欣1，2，孟庆恒1，2*

（1.天津师范大学生命科学学院，天津300387；2.天津市动植物抗性重点实验室，天津300387）

实验以菌株Sr18（Syncephalastrum racemosum）为发酵对象，以杀线虫活性为考察指标，在5 L、30 L发酵研究基础上，进行了200 L和5 t发酵罐水平上的规模发酵实验。结果显示，200 L罐发酵工艺参数为接种量4%，发酵温度26℃，罐压0.05～0.12 MPa，空气流量4～9 m3/h，转速120～198 r/min，发酵周期48 h；5 t罐发酵参数为接种量4%，发酵温度26℃，罐压0.03 MPa，空气流量65～80 m3/h，转速80～90 r/min，发酵周期40 h。在此发酵条件下，200 L和5 t罐的1倍稀释发酵液的杀线虫活性均可达到100%，表明实验所设定的发酵参数适用、可控。

菌株Sr18；杀线虫代谢产物；规模发酵；杀线虫活性

根结线虫在世界范围内分布广泛，侵染作物后植物根部形成根结，严重影响植物对养分和水分等物质的吸收和利用，造成了严重的农业经济损失[1]。线虫的防治措施中，生物防治由于其环境相容性好、二次污染小等优点而受到广泛关注，其中真菌生防制剂的关注度更高，已有淡紫拟青霉（Paecilomyces lilacinus）和厚垣普奇尼亚菌（Pochonia chlamydosporia）制成的杀线剂在我国实现商业应用[2-3]，更多的相关研究正在积极的进行当中[4-8]。

菌株Sr18（Syncephalastrum racemosum）即是一株研究较为深入的杀线虫真菌。前期研究表明，菌株Sr18代谢物具有广谱杀线作用，对南方根结线虫（Meloidogyn incognita）、松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）和大豆孢囊线虫（Heterodera glycines Ichinohe）均有很强的毒力作用，尤其是对根结线虫，处理24h后校正死亡率达100%[9]，并具有快速击倒和杀死效应，药效随时间的延长而增加[10]。进一步的温室黄瓜栽培实验发现，该菌代谢物可通过提高黄瓜植株体内抗氧化酶如超氧化物歧化酶（superoxyde dismutase，SOD）、过氧化物酶（peroxidase，POD）、过氧化氢酶（catalase，CAT）的活性，以及提升保护酶如多酚氧化酶（polyphenoloxidase，PPO）和苯丙氨酸解氨酶（phenylalanine ammonialyase，PAL）的含量，提高植株对线虫的抗性，实现对宿主的保护作用[11]。田间试验结果还发现，菌株Sr18代谢物不仅可使虫口密度明显减退，而且增产显著，效果高于益舒丰和灭虫灵[12]。理化性质研究结果表明，其代谢物活性组分具有分子质量小、耐热、水溶性好、环境相容性好等优点[13]，显示出良好的开发应用前景。

本研究以前期5 L和30 L发酵工艺参数为参照[14]，对200 L和5 t发酵罐条件下规模发酵进行了有益的尝试，以验证动态参数在规模发酵过程中工艺条件的可控性，旨在为今后菌株Sr18代谢物的大规模生产提供实验依据。目前，对菌种实施大规模发酵技术的研究已成为生防制剂开发应用的瓶颈，导致生防制剂虽然研究众多，但只有少数生防菌株被开发为商业化制剂，大部分仍停留在实验室阶段[2]，而进行5 t罐规模发酵的研究更不多见，这也是本研究在初期小容积发酵技术的基础上进行200 L和5 t罐规模发酵试验的关键所在，对于该菌株从实验室研究阶段，顺利过度到大规模发酵生产阶段具有重要意义[15-17]。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 供试菌种及线虫

菌株Sr18（Syncephalastrum racemosum）：天津师范大学生命科学院微生物实验室；松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）：中国林科院森保所。

1.1.2 化学试剂

蔗糖、麦芽精（生化试剂）：天津市化学试剂一厂；琼脂（生化试剂）：天津市化学试剂三厂；次氯酸钠（分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.1.3 供试培养基

斜面活化培养基采用马铃薯蔗糖琼脂（potato sucrose agar，PSA）培养基：20 g/L蔗糖，2 g/L麦芽精，20 g/L琼脂，溶于1 L土豆汁中（300 g/L），pH自然。0.1 MPa灭菌20 min。

发酵罐培养基（200 L）：土豆48 kg，蔗糖3.0 kg，麦芽精0.50 kg，泡敌少许，pH自然。

发酵罐培养基（5 t）：土豆1 000 kg，蔗糖65.8 kg，麦芽精6.58 kg，泡敌适量，pH自然。

1.2 仪器与设备

SPX-150B-Z型生化培养箱：上海博迅实业有限公司；SW-CJ-1F型净化工作台：苏州净化设备有限公司；200 L、5 t自动发酵罐、FPC-2000型发酵过程集散控制系统：江苏绿环生化工程成套装备有限公司；RPN-P100、RPN-P 300型真空浓缩锅：陕西三原宏达实业公司轻工设备厂；L-100型喷雾塔：新星兽药厂；SX500型全自动高压蒸汽灭菌锅：日本Tomy Digital Biology公司；DB型电热恒温干燥箱：天津市华北实验仪器有限公司；LDZ5-2型雷勃尔离心机：北京雷勃尔离心机有限公司；XTB-A 5538型体视显微镜：桂林光学仪器厂；k-25血球计数板：上海求精生化试剂仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 200 L罐发酵培养

菌种的活化培养：将保藏的菌株Sr18接入斜面活化培养基，26℃条件下静置培养5～7 d。

孢子悬液的制备：活化培养两代的菌株Sr18，用接种环挑取3～5环孢子至无菌水中，k-25血球计数板测定菌浓度，备用。

一级种子制备：50 L罐，装液量46%，接种量16%，培养24 h，备用。

200 L发酵培养：装液量63%，接种量4%，培养48 h。发酵过程中每隔4 h取样，待测。

1.3.2 5 t罐发酵培养

一级种子制备：500 L罐，装液量50%，接种量15%，培养24 h，备用。

5t发酵培养：装液量66%，接种量4%，发酵时间为40 h。发酵过程中每隔4 h取样，待测。

1.3.3 生物量的测定

采用菌体干质量法：将发酵液用已称质量的干燥滤纸进行真空抽滤，然后将菌体和滤纸置于干燥皿内，置于105℃烘箱内，烘干至前后两次称质量不变，计算菌体干质量。

1.3.4 杀线虫活性测定

松材线虫由灰葡萄孢（Botrytiscinerea）培养保种，通过大麦仁培养基大量培养后，经过贝尔曼漏斗法收集，用无菌水清洗3次，离心分离后，用无菌蒸馏水调制成1 500条/mL的线虫悬浮液。

取96孔细胞培养板，每孔加入发酵液100 μL以及线虫悬浮液100μL，25℃条件下保湿培养，每个处理重复3次，设灭菌水为空白对照（CK）。在5d后进行检测计数，向有死虫的孔中加入一滴1mol/L的NaOH溶液，30s内从直线状变成弯曲状判定为活虫[9]，计算松材线虫的死亡率（即杀线虫活性）。

2 结果与分析

2.1 200 L发酵培养及动态分析

200 L罐发酵参数动态变化如图1所示。由图1可知，0～12 h菌体干质量整体呈现逐渐增加的趋势，但菌体干质量增加较缓慢，处于适应新的发酵环境的延迟期；12～28 h菌体快速生长，干质量大幅增加，表现出对数生长期的特点；28～40 h为稳定期，菌体干质量呈小幅波动变化，进入生产的收获期。

图1200 L罐发酵过程中动态曲线Fig.1 Dynamic curve of fermentation in 200 L fermenter

pH值整体上呈现逐渐下降的趋势，28 h后由初始的6.46下降到2.00，之后基本维持稳定，与生物量呈负相关。杀线虫活性测定结果显示，发酵24h取样处理松材线虫5 d，杀线虫活性达到98%以上，且与菌体的生长呈正相关，表明活性产物的发酵类型应属于菌体生长相关的偶联型。

2.2 5 t发酵培养及动态分析

5 t罐发酵过程中各参数动态变化如图2所示。由图2可知，与200 L罐的生长曲线相似，菌体干质量整体呈逐渐增加的趋势，延迟期菌体生长缓慢，生物量最高为0.647 g/L，12 h后进入对数生长期，生物量快速增加，40 h时5 t罐取样的菌体干质量可达4.242 g/L。

图25 t罐发酵过程中动态曲线Fig.2 Dynamic curve of fermentation in 5 t fermenter

发酵滤液的pH值同样呈逐渐下降的趋势，这与菌株Sr18代谢物中有机酸的生成有关[18]，发酵40 h时pH值降到1.86，此时已不适宜菌株生长和继续生产代谢产物，因此pH值可作为发酵终止的重要参数。发酵滤液的杀线虫活性整体上呈现逐渐增加的趋势，发酵的前20 h发酵滤液杀线虫活性较低，可能是受到了生物量偏低的影响。20h以后，随着菌体生成量的增加，杀线虫活性迅速上升，由28.27%增加至89.28%，增加了大约3倍，36 h发酵滤液的杀线虫活性可达到100%。

2.3 5 t罐条件下溶氧量的变化及控制

发酵过程中溶氧量变化及控制参数见图3。由图3可知，发酵初始，转速和空气流量分别设置为90 r/min、80 m3/h，罐压为0.03 MPa，此时相对溶氧量设为100%。发酵过程中，溶氧量整体呈现下降的趋势，8 h后急剧下降，同时菌体干质量大幅增加，pH值快速降低，说明此时菌体快速生长，产生酸性代谢产物。在28 h后，溶氧量出现轻微的上升趋势，同时pH值下降速度减缓，菌体干质量出现下降，表明菌体生长已受阻，此时降低转速和空气流量分别至80 r/min、65 m3/h，以减少由于搅拌对菌体造成的剪切损伤和气泡的生成，使菌体在比较适宜的条件下继续生长，积累代谢产物。调节转速和空气流量后，菌体干质量开始上升，代谢物杀线虫活性上升，36 h时达到100%，pH值降至1.91，此时已不适合菌体生长，预示到达发酵终点。

图35 t罐发酵过程中的参数变化Fig.3 Changes of fermentation parameters in 5 t fermenter

2.4 发酵滤液杀线虫活性的比较

发酵终止后，取不同浓度发酵滤液处理松材线虫5 d的杀线虫活性结果见图4。由图4可知，200L罐和5t罐的发酵滤液原液和1倍稀释液（1/2原液）杀线虫活性均达到100%，当发酵滤液稀释至1/4原液浓度后，200 L罐的杀线虫活性为85.70%，而5 t罐的杀线虫活性为88.71%，对松材线虫的致死效果较好，表明实验设定的参数和对溶氧的控制对5 t罐的发酵是适用而有效的。

图4 发酵滤液的杀线虫活性Fig.4 Nematicidal activity of fermentation broth

3 结论

研究结果表明，菌株Sr18代谢物杀线虫活性随菌体的生长逐渐增加，表明活性产物的生成与菌体的生长呈正相关，菌株Sr18活性代谢物的发酵应属于偶联型（I型）发酵。菌株Sr18杀线虫代谢物200 L罐的发酵工艺参数为：发酵温度26℃，罐压0.05～0.12 MPa，空气流量4～9 m3/h，搅拌速度120～198 r/min，pH自然，发酵终止时间48 h，在此发酵条件下，菌株Sr18代谢产物的杀线虫活性较高，3倍稀释液的杀线虫活性仍达85%以上；5 t罐的发酵工艺参数为：发酵温度26℃，罐压0.03 MPa，空气流量65～80 m3/h，搅拌速度75～90 r/min，pH自然，发酵终止时间40 h，在此发酵条件下，发酵36 h时代谢产物的杀线虫活性即达到100%，发酵终止后，发酵液稀释至1/4原液浓度的杀线虫活性仍能达到88.71%，显示出良好的杀线虫活性。菌株Sr18的规模发酵研究为今后投入规模化生产应用奠定了基础。

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Scale-up fermentation and nematocidal efficiency of nematicidal metabolites by strain Sr18

WANG Yaping1,WANG Xiuqing1,SUN Jianhua1,2,FENG Xin1,2,MENG Qingheng1,2*
(1.College of Life Science,Tianjin Normal University,Tianjin 300387,China; 2.Tianjin Key Laboratory of Animal and Plant Resistance,Tianjin 300387,China)

Using the nematocidal activity as evaluation index,on the basis of 5 L and 30 L fermentation research,the strain Sr18(Syncephalastrum racemosum)was cultured in the scale of 200 L and 5 t fermenter.The results showed that the fermentation conditions of 200 L fermenter was as follows:inoculum 4%,fermentation temperature 26℃,vessel pressure 0.05-0.12 MPa,air flow rate 4-9 m3/h,rotational speed 120-198 r/min and fermentation cycle 48 h.The fermentation conditions in the scale of 5 t fermenter was as follows:inoculum 4%,fermentation temperature 26℃, tank pressure 0.03 MPa,air flow rate 65-80 m3/h,rotational speed 80-90 r/min and fermentation cycle 40 h.Under the fermentation conditions,the nematicidal activity of one time diluted fermentation broth could reach 100%,which indicated that the fermentation parameters were suitable and controllable.

strain Sr18;nematicidal metabolites;scale fermentation;nematicidal activity

Q939.9；S435.6

0254-5071（2017）04-0054-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.012

2017-01-01

国家自然科学基金（31272019）

王亚萍（1990-），女，硕士研究生，研究方向为微生物发酵和植物抗性。

*通讯作者：孟庆恒（1963-），男，副教授，硕士，研究方向为应用微生物。