姬松茸发酵种龄筛选及发酵动力学分析

曹新志，赵迎庆，杨建刚，刘佳，任林生

（1.四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000；2.山东润牧生物科技有限公司，山东临沂276600）

姬松茸发酵种龄筛选及发酵动力学分析

曹新志1，赵迎庆2，杨建刚1，刘佳1，任林生1

（1.四川理工学院生物工程学院，四川自贡643000；2.山东润牧生物科技有限公司，山东临沂276600）

研究了不同种龄对姬松茸液体发酵过程中菌丝体干质量、胞外多糖含量、蔗糖利用率的影响，并运用动力学分析的方法对姬松茸菌体发酵菌丝体干质量、胞外多糖含量、蔗糖利用率、溶氧进行相关分析。结果表明，4 d种龄的姬松茸发酵液的菌丝体干质量、胞外多糖含量和蔗糖利用率均优于其他种龄的姬松茸发酵液，且通过5 L发酵罐放大试验菌丝体干质量、胞外多糖含量、蔗糖利用率分别为1.417 g/100 mL、6.967 g/L、82.5%，较摇瓶发酵培养分别提高了45.37%、20.41%、5.87%。通过各发酵参数的相关性分析表明，姬松茸液体深层发酵菌丝体干质量、胞外多糖含量同蔗糖利用率、溶氧之间存在一定的相关性。

姬松茸；液体发酵种龄；胞外多糖；蔗糖利用率；动力学分析

姬松茸（Agaricus blazeiMurill）又称巴西蘑菇、柏氏蘑菇、小松菇[1-3]，是一种珍稀的食药兼用真菌[4-5]。其所含的生物活性物质（如糖类、多肽、甾醇、食用纤维等），具有明显的抗肿瘤、改善免疫系统功能、调节血糖、降血压、抗辐射、调节机体代谢、保护肾脏、抗疲劳、改善骨质疏松等作用[6-8]。据报道姬松茸多糖、蛋白具有抑制肿瘤、抗诱变、增强机体免疫功能、保护肝脏、抗毒素及抗氧化等保健功能[9-10]，因此姬松茸的开发利用越来越受到人们的关注。以前多采用姬松茸子实体进行研究和工业生产，近年来，随着对食药用真菌研究的深入及其商品化程度的深入，早已不再仅利用其子实体作为食品和药品，而是利用液体发酵技术对其进行发酵培养为其商品化提供了更为简便、快捷、有效的途径。

食药用真菌的液体培养已成为发酵工程技术中重要的一部分，利用该技术生产菌丝体，充分显示出生产周期短、产量高、成本低、质量可控的优势。此外，目前姬松茸的很多研究集中在其摇瓶发酵的影响因素，如培养基筛选、培养条件、多糖提取工艺、多糖活性研究等方面[11]。目前国内外对姬松茸液体发酵种龄展开工作研究的甚少，董秀萍等[12]研究了姬松茸种龄对胞外多糖、胞外酶的影响，结果表明，发酵期间菌种生长的快慢和产物合成的多少在很大程度上取决于种子的质量。种子质量一般是指接种种龄和接种量的选择，最适的发酵接种种龄对姬松茸增殖、胞外产物的积累影响很大。一般种龄选择对数生长的中后期，此时菌种其遗传特性稳定，并对其所处的环境条件已经适应，因此合适种龄对姬松茸生长及代谢都有显著的影响。本试验研究了种龄对姬松茸液体发酵过程中生物量、残糖量、胞外多糖含量的影响，并采用5 L发酵罐对最适种龄姬松茸菌种进行发酵动力学分析，以期对姬松茸液体发酵、产品分离及降低生产成本、姬松茸产品的开发、工业化生产提供重要的指导意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 菌种来源

姬松茸菌种（菌种编号ABM-3）：华中农业大学菌种保藏中心。

1.1.2 试剂

葡萄糖、麦芽糖、乳糖、可溶性淀粉、硝酸钾、硫酸铵、尿素、间苯二酚（均为分析纯）：成都科龙化工试剂厂；蛋白胨、酵母浸粉（均为生化试剂）：北京奥博基生物技术有限责任公司；工业玉米浆：天津利发隆化工科技有限公司；蔗糖、马铃薯、麸皮、玉米粉、黄豆粉：购于自贡农贸市场。

1.1.3 培养基

斜面培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，MgSO4·5H2O 0.2 g，琼脂20 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。

基础发酵培养基：马铃薯200 g，葡萄糖20 g，KH2PO42 g，MgSO4·5H2O 0.2 g，蒸馏水1 000 mL，pH自然。

液体发酵培养基：蔗糖57.5 g/L，工业玉米浆2.05 g/L，KH2PO42 g/L，MgSO4·5H2O 0.2 g/L，维生素B10.01 g/L，pH自然。

1.2 仪器与设备

SW-CJ-IB型超净工作台：苏州净化设备厂；G2-250-S型恒温培养箱：韶关市广智科技设备有限公司；YX-280B型手提式蒸汽压力灭菌锅：江阴滨江医疗设备厂；SKY-2102C型全温型恒温振动摇床：上海沪粤明科学仪器有限公司；DHG-9140A型电热恒温鼓风干燥箱：上海一恒科技有限公司；722型分光光度计分光光度计：上海光谱仪器有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 液体种子的培养

将姬松茸菌种接种到斜面培养基中，于25℃恒温培养箱中活化12 h。在无菌条件下，从已经活化的斜面菌种中，挑取4～5块约0.5 cm×0.5 cm大小的菌块，接种到装液量为100 mL/200 mL的基础发酵培养基中，接种的菌苔要薄，这样可使接种的菌苔漂浮在培养基液面上，静置培养48 h[13]，然后在25℃、150 r/min条件下培养4 d。

1.3.2 姬松茸液体发酵曲线的绘制

无菌条件下，用移液管吸取10 mL种子液，接种到装液量为90 mL/200 mL的基础发酵培养基中，编号1～14，每组做5组平行试验，置于25℃、150 r/min的恒温摇床培养，按照编号每隔12 h测定发酵液中菌体干质量，绘制姬松茸液体发酵曲线。

1.3.3 种龄对姬松茸液体发酵的影响

依据姬松茸液体发酵曲线，无菌条件下，分别取10 mL 3～7 d种龄的种子液接种到装液量为90 mL/200 mL液体发酵培养基中，每组做3组平行试验，置于25℃、150 r/min的恒温摇床培养，按照编号每隔24 h测定发酵液中菌丝体干质量、胞外多糖含量、蔗糖利用率。

1.3.4 检测方法

姬松茸发酵液菌丝体干质量的测定：参照周选围[14]的方法进行测定，即为姬松茸发酵生物量。

胞外多糖的提取及其含量的测定：发酵结束后，2 500 r/min离心发酵液，收集上清液，于40℃减压浓缩至原体积的1/3左右，取50 mL浓缩上清液，加入283 mL无水乙醇至乙醇体积分数为85%，4℃静置过夜，2 500 r/min离心10 min，沉淀经恒温干燥箱干燥至质量恒定，最后用蒸馏水溶解粗多糖至50 mL，采用3,5-二硝基水杨酸（3,5-dinitrosalicylic acid，DNS）法[15]测定其还原糖含量，苯酚-硫酸法测定总糖[16]。获得还原糖含量的标准曲线回归方程为y=0.880 2x-0.024 4；R2=0.998 3；总糖含量的标准曲线回归方程为y=0.189 3x+0.000 4；R2=0.999 4。姬松茸胞外多糖含量的计算公式如下：

式中：P为姬松茸胞外多糖含量，g/L；T为总糖含量，g/L；R为

还原糖含量，g/L；S为蔗糖含量，g/L。

蔗糖利用率的测定：采用Roe比色法[17]测定姬松茸发酵液中蔗糖含量，计算蔗糖利用率。蔗糖利用率计算公式如下：

式中：R为蔗糖利用率，%；C1为发酵液中蔗糖初始含量，g/L；C2为发酵过程中蔗糖测定量，g/L。

溶氧（dissolvedoxygen，DO）消耗的测定：发酵液溶氧采用溶氧电极进行测定，其溶氧值在发酵罐控制屏中直接显示。培养基灭菌结束循环水浴降温至发酵温度，向培养基通风搅拌至溶解氧达到饱和，此时溶氧电极读数定义为100.0。

2 结果与分析

2.1 姬松茸液体发酵曲线

依次收集编号1～14号姬松茸发酵液，绘制姬松茸液体发酵曲线如图1所示。由图1可知，姬松茸初始加入量为0.07 g/100 mL，培养时间0～0.5 d时，菌丝体干质量缓慢增加，培养时间0.5～3d时，菌丝体干重增加迅速，当培养时间为3 d时，菌丝体干质量增长趋向平稳，此时菌丝体干质量为0.643 g/100 mL，3～6 d菌丝体干质量平稳增加，6 d过后菌丝体干质量呈现下降趋势，因此根据姬松茸液体发酵曲线选择种龄为3～6 d的姬松茸菌体进行下一步试验。

图1 姬松茸菌体液体发酵曲线Fig.1 Liquid fermentation curve ofAgaricus blazeiMuril

2.2 不同种龄姬松茸对发酵液生物量的影响

考察不同种龄姬松茸对发酵液生物量的影响，结果见图2。由图2可知，随着发酵时间的延长，不同种龄姬松茸菌体发酵液中生物量均呈先增加后减少的趋势，当发酵4 d时，各种龄的发酵液中生物量均达到最大值，其中种龄为4d的姬松茸发酵液中生物量最大，为0.774 g/100 mL，优于其他种龄的姬松茸发酵液生物量，原因可能是种龄为4 d的姬松茸菌体生长达到了平稳期，这时菌体活性强，接种到新的培养环境中能够很快的适应环境，菌体迅速增长。因此，确定4 d为姬松茸发酵接种最适种龄。

图2 不同种龄姬松茸对发酵液菌丝体干质量的影响Fig.2 Effect of different inoculum ages ofAgaricus blazeiMurill on mycelia dry mass

2.3 不同种龄姬松茸对发酵液蔗糖利用率的差异

考察不同种龄姬松茸对蔗糖利用率的影响，结果见图3。由图3可知，随着发酵时间的延长，蔗糖利用率总体呈上升趋势。其中种龄为4 d的姬松茸液体母液的蔗糖利用率要优于其他种龄姬松茸液体母液，蔗糖利用率可达到77.71%，主要是因为种龄为4 d的姬松茸液体母液菌体生长旺盛，能够很好地利用培养基中的蔗糖，因此4 d种龄的姬松茸液体母液蔗糖利用率最高。

图3 不同种龄姬松茸对蔗糖利用率的影响Fig.3 Effect of different inoculum ages ofAgaricus blazeiMurill on sucrose utilization ratio

2.4 不同种龄姬松茸对发酵液胞外多糖含量的影响

分别将3～6 d种龄的姬松茸发酵液接种到液体发酵培养基中，每隔24 h取样检测胞外多糖含量，结果见图4。由图4可知，在菌体发酵初期胞外多糖含量增长总体呈现平缓态势，当培养到第3天时，发酵液中胞外多糖含量增长速度开始增加；当培养到第6天时，胞外多糖含量增长速度趋于平缓，最终达到5.545 g/L；4 d种龄的姬松茸液体发酵液中胞外多糖含量高于其他种龄姬松茸发酵，因此，4 d种龄姬松茸液体母液胞外多糖含量最高。

图4 不同种龄姬松茸对胞外多糖含量的影响Fig.4 Effect of different inoculum ages ofAgaricus blazeiMurill on extracellular polysaccharide content

2.5 姬松茸5 L发酵罐发酵曲线及其动力学分析

通过不同种龄对姬松茸发酵影响的研究，4 d种龄姬松茸的生物量、蔗糖利用率、胞外多糖含量均优于其他种龄姬松茸，因此选择4 d种龄为宜。为了进一步了解最适发酵种龄的发酵情况，本研究采用5 L发酵罐进行放大实验，研究发酵过程中姬松茸菌丝体干质量、胞外多糖含量、蔗糖利用率、溶氧量的变化，并对姬松茸液体发酵曲线进行动力学分析，阐述姬松茸菌体发酵生长状况，结果见图5。对各发酵参数利用SPSS20进行相关性分析，结果见表1。

图5 姬松茸发酵动力学曲线Fig.5 Fermentation dynamics curve ofAgaricus blazeiMurill

由图5可知，在发酵第3天时，姬松茸菌体干质量已经达到了最大值，主要原因可能是发酵罐的高溶氧通气量和搅拌转速造成的。较摇床培养姬松茸发酵菌丝体干质量提前1 d到达发酵最高点，此时姬松茸菌丝体干质量为1.417 g/100 mL，较摇瓶发酵培养提高了45.37%，由溶氧曲线可知，发酵过程前期（0～1.5 d）的溶氧变化很小，这是由于发酵初期菌体生长速度缓慢造成的，随着发酵的进行，溶氧开始明显的下降，姬松茸菌丝体经过适应期发酵后，进入对数生长期，菌体的大量增殖快速消耗培养基中的氧气。由表1相关性分析可知，姬松茸菌丝体干质量与溶氧相关系数为-0.986（P＜0.01），菌丝体干质量与蔗糖利用率相关系数0.915（P＜0.05），具有统计学意义，同时也印证了图5中姬松茸菌体干质量、溶氧变化曲线、蔗糖利用率曲线。发酵液中胞外多糖含量和蔗糖利用率与菌丝体干质量相关系数为-0.947（P＜0.01），胞外多糖含量与溶氧相关系数为-0.929（P＜0.01），说明姬松茸分泌的胞外多糖含量与蔗糖利用率和溶氧量有着密切的关系。随着菌体的快速生长，当发酵进入平稳期后，产生大量的胞外多糖，发酵液中蔗糖利用率随菌体的生长不断增加，当发酵到第7天时，菌体生长速度减慢，胞外多糖的产量渐趋达到最大值，此时胞外多糖含量为6.967 g/L，蔗糖利用率为82.5%，较摇床发酵培养分别提高了20.41%、5.87%。发酵到第7天以后，由于菌体的自溶和发酵液中各种酶的存在，多糖被酶降解，发酵液的胞外多糖含量呈现下降趋势度；而蔗糖利用率增长速率也开始减缓。

表1 姬松茸发酵参数相关性分析Table 1 Correlation analysis of fermentation parameters of Agaricus blazeiMurill

通过5 L发酵罐放大试验及动力学分析，结果表明，姬松茸菌丝体干质量和胞外多糖含量同溶氧和蔗糖利用率之间存在一定相关性，通过与摇床发酵培养对比，5 L发酵罐培养在菌丝体干质量、胞外多糖含量、蔗糖利用率方面均优于摇床发酵培养。

3 结论

本试验通过测定不同种龄对姬松茸发酵液中生物量、蔗糖利用率和胞外多糖含量，研究了种龄对姬松茸液体发酵的影响，并对姬松茸发酵动力学进行了分析。结果表明，4d种龄的姬松茸发酵液的生物量、蔗糖利用率和胞外多糖含量均优于其他种龄的姬松茸发酵液。通过对4 d种龄姬松茸进行5L发酵罐放大试验结果表明，菌丝体干质量为1.417 g/100 mL、胞外多糖含量6.967 g/L和蔗糖利用率为82.5%，较摇瓶发酵培养分别提高了45.37%、20.41%和5.87%；通过各发酵参数的相关性分析表明，姬松茸液体深层发酵姬松茸菌丝体干质量和胞外多糖含量同溶氧和蔗糖利用率之间存在一定相关性，为姬松茸液体发酵工业化生产提供了一定的理论支持和技术支持。

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Screening of inoculum age and fermentation dynamics analysis ofAgaricus blazeiMurill

CAO Xinzhi1,ZHAO Yingqing2,YANG Jiangang1,LIU Jia1,REN Linshen1
(1.College of Bioengineering,Sichuan University of Science&Engineering,Zigong 643000,China; 2.Shandong Runmu Bio-technology Co.,Ltd.,Linyi 276017,China)

The effects of inoculum age ofAgaricus blazeiMurill on mycelia dry mass,extracellular polysaccharide content and sucrose utilization ratio during liquid fermentation were researched.And the correlation of mycelia dry mass,extracellular polysaccharide content,sucrose utilization ratio and dissolved oxygen(DO)were analyzed by dynamics analysis method.The results showed that mycelia dry mass,extracellular polysaccharide content and sucrose utilization ratio ofAgaricus blazeiMurill with inoculum age 4 d were all better than that of other inoculum age,and were 1.417 g/100 ml,6.967 g/L and 82.5%,respectively,by 5 L fermenter tests,which was 45.37%,20.41%and 5.87%higher than that of shake flask fermentation culture.The correlation analysis of fermentation parameters showed that the mycelia dry mass and extracellular polysaccharide content ofAgaricus blazeiMurill in submerged fermentation had a certain correlation with sucrose utilization ratio and dissolved oxygen DO.

Agaricus blazeiMurill;inoculums age of the fermentation;exopolysaccharides;sucrose utilization;dynamics analysis

TS201.1

0254-5071（2017）04-0114-04

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.024

2016-07-25

四川省省属高校科研创新团队项目（16TD0026）

曹新志（1965-），男，教授，博士，研究方向为食品生物技术。