烟曲霉酸的发酵培养基优化和反应器放大研究

徐帆，朱一翔，卢艳花*

（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海200237）

烟曲霉酸的发酵培养基优化和反应器放大研究

徐帆，朱一翔，卢艳花*

（华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海200237）

烟曲霉酸是一种四环三萜类结构的化合物，具有良好的抗菌活性和抗癌效果。该研究在单因素试验的基础上，对来源于海洋的烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）CY018发酵生产烟曲霉酸的培养基进行了优化及放大培养。结果表明，优化后发酵培养基为甘露醇39.88 g/L，硝酸钠2.25 g/L，牛肉膏3.54 g/L，丁二酸钠8.4 g/L，硫酸镁0.3 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，磷酸二氢钾0.67 g/L。初始pH值调至4.2，摇瓶装液量50 mL/250 mL，转速160 r/min，28℃培养9 d。在此优化培养基及发酵条件下，烟曲霉酸的产量达到68.49 mg/L，为优化之前的4.1倍。并在此基础上进行了5 L反应器的放大研究，在发酵第7天得到了烟曲霉酸的最大产量为54.81 mg/L。该实验为HA生产的放大制备与应用推广打下了基础。

烟曲霉酸；烟曲霉；发酵培养基；优化；反应器放大

烟曲霉酸（helvolic acid，HA）是烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）次级代谢得到的四环三萜结构类化合物，有着良好的抗菌活性。通过与青霉素、红霉素、四环素共同使用，能够对金黄色葡萄球菌等多药物抵抗的强力细菌展现有效的抑菌活性[1-4]。另一方面，HA对于癌细胞HeLa和HepG2的生长也展现出了抑制效果。这种抗菌和抗癌的生物活性使HA有着很高的药用潜力[5]。但是，较低的HA产量限制了它的研究和应用推广。根据之前的文献报道，通过烟曲霉菌CY018液态发酵得到的HA最高产量仅为16.88 mg/L[6]。因此，需要通过优化HA的发酵培养基来提高产量，并进行工艺的放大探索。

根据目前提高HA产量的研究报道，WUQ等[6]通过一株来源于海洋的海蟹共生菌烟曲霉菌CY018，研究产HA和烟曲霉文丙的共同发酵条件优化。但是，这两种次级代谢产物在代谢途径中有一部分相同的代谢步骤，这表明这两种产物的合成是存在竞争关系的。并且，之前的研究只在摇瓶水平进行实验，但HA的规模化制备是建立在反应器放大研究的基础上的。因此，目前缺少针对HA的发酵条件优化与反应器放大研究。

在发酵的过程中，发酵培养基对于优化发酵产量很重要。传统的研究方法仅通过单因素试验优化培养基，但是这种方法并不高效，并且无法考虑多因素优化过程中各因素之间的相互作用[7]。数理统计法（statistic methods）在处理多因素优化时非常高效[8]。通过Plackett-Burman试验设计，能快速从大量因素中筛选出显著性的因素[9]。通过最陡爬坡试验（path of steepest ascent）找出各关键因素最适合的浓度范围[10]。但是这两种方法仅考虑了一阶效应，并没有涉及各因素的相互作用。为了克服这些限制，采用响应面法（response surface methodology，RSM），研究各因素及其交互作用，进行回归分析优化工艺过程参数，进而反映出关键变量的贡献度并预测相应的影响规律[11]。

本实验以高产HA的菌株海蟹共生菌烟曲霉（Aspergillus fumigatus）CY018为研究对象，采用单因素试验优化培养基中的碳氮源，得到合适的培养基组分后，通过Plackett-Burman试验设计找出显著性因素，通过最陡爬坡试验找出最优浓度范围，再运用Box-Behnken试验设计优化HA的发酵培养基。在完成摇瓶水平的优化之后，在5 L反应器中进行了HA规模化发酵过程的初步探索，为今后HA的放大制备与应用推广打下了基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试剂

甲醇、乙酸乙酯（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；乙腈（色谱纯）：美国TEDIA有限公司；Antifoam 204消泡剂：美国Sigma有限公司；HA标准品（纯度＞95%）：南京大学谭仁祥教授提供；其余试剂均为国产分析纯。

1.1.2 菌株

本研究所采用的HA高产菌株为烟曲霉菌（Aspergillus fumigatus）CY018，由南京大学课题组筛选并提供，菌种的保藏号为CGMCC No.1371。

1.1.3 培养基

活化培养基：称取200g马铃薯，粉碎后加水煮沸30min，用八层纱布过滤后收集滤液，加10 g葡萄糖，1.5 g硫酸镁，3 g磷酸二氢钾，0.05 g维生素B1，加水补足至1 000 mL，分装后加入2%的琼脂，121℃灭菌15 min，备用。

种子培养基：葡萄糖35g/L，蛋白胨5g/L，酵母膏2.5g/L，磷酸二氢钾1 g/L，硫酸镁0.5 g/L，维生素B10.05 g/L。分装后121℃灭菌15 min，备用。

基础发酵培养基：甘露醇50 g/L，丁二酸钠5.4 g/L，硝酸钠2 g/L，硫酸镁0.3 g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，磷酸二氢钾0.67 g/L。pH调至4.2，分装后121℃灭菌15 min，备用。

1.2 仪器与设备

SHJ-JP超净工作台：上海净化设备厂；SCL-10AVP高效液相色谱（highperformance liquidchromatography，HPLC）：日本岛津公司；Agilent ZORBAX Eclipse XDB-C18色谱柱（5 μm，4.6 mm×250 mm）：美国安捷伦科技公司；ZD-9556水平摇床：太仓市教科器材厂；Centrifuge 5415R高速冷冻离心机：德国Eppendorf公司。

1.3 试验方法

1.3.1 种子培养与发酵条件

将烟曲霉菌（A.fumigatus）CY018接到活化培养基，在28℃的条件下培养5 d，加入50 mL种子培养基和约15颗无菌小玻璃珠，轻微振荡，让菌体悬浮均匀，把2 mL的悬浮液移入到装液量为50 mL/250 mL的种子培养基中，摇床转速为160 r/min，在28℃的条件下培养36 h。将种子液以10%（V/V）的接种量接入发酵培养基中，摇床转速为160 r/min，28℃条件下发酵9 d。

1.3.2 建立HA的HPLC检测方法

样品预处理：将发酵液抽滤，收集菌体和发酵液。将菌体置于60℃烘箱内干燥至恒质量，称量干质量后加入研钵碾磨以破碎细胞，加入发酵液中，用等体积的乙酸乙酯萃取2遍，将有机相收集于离心管中。将萃取液装入250mL圆底烧中，在45℃的条件下减压蒸发，然后加入10 mL的甲醇超声溶解，取2 mL溶解液于EP管中，在转速13 000 r/min条件下离心，取上清液至2mLEP管中，保存于4℃冰箱待测。

HA标准溶液制备：用天秤准确称量HA标准品1.3 mg，加入1 mL甲醇溶解，然后稀释10倍，用微孔滤膜过滤，测定制作HA标准曲线。

洗脱条件：A相为体积分数0.1%的三氟乙酸水溶液，B相为纯乙腈。采用梯度洗脱程序见表1。

表1 流动相梯度洗脱程序Table 1 Gradient elution procedures of mobile phase

检测条件：紫外检测检测器的检测波长230 nm，柱温箱温度：30℃，流速：1 mL/min。

1.3.3 发酵过程中参数的测定

通过测定菌体干质量（dry cell weight，DCW）来判断烟曲霉菌CY018的生长状态，通过比色法测定残糖量（甘露醇）[12]，以了解发酵过程中碳源的消耗水平。通过pH电极测定发酵液的pH。通过溶氧电极测定发酵液的溶氧量（dissolved oxygen，DO）。

1.3.4 发酵培养基优化单因素试验

氮源的确定：在基础培养基中添加了4种有机氮源（添加量均为3 g/L的蛋白胨、酵母提取物、牛肉浸膏、玉米粉），在种子培养36 h之后，以10%的接种量接入到发酵培养基，摇床的转速为160 r/min，pH调整为4.2，在28℃的条件下发酵9 d，测定发酵液中HA的产量。

碳源的确定：把基础培养基的甘露醇替换为不同的碳源（添加量均为34 g/L葡萄糖、蔗糖、麦芽糖、可溶性淀粉、果糖），在种子培养36 h之后，以10%的接种量接入到发酵培养基，摇床的转速为160 r/min，pH调整为4.2，在28℃的条件下发酵9 d，测定发酵液中HA的产量。

1.3.5 响应面法优化发酵培养基

（1）Plackett-Burman试验

通过Design Expert 8设计Plackett-Burman试验来筛选能影响HA产量的显著性因素。试验设计的因素包括甘露醇（A）、硝酸钠（B）、硫酸镁（C）、硫酸亚铁（D）、磷酸二氢钾（E）、丁二酸钠（F）和牛肉浸膏（G）添加量。分别对各个因素设置高水平和低水平添加量，以发酵结束后HA的产量（Y）为评价指标，Plackett-Burman试验因素与水平见表2。

表2Plackett-Burman试验设计因素与水平Table 2 Factors and levels of Plackett-Burman experiments design g/L

（2）最陡爬坡试验

通过Placket-Burman试验找出的显著性因素后，采用最陡爬坡试验找出HA产量最高的数据作为之后优化的最优范围。

（3）Box-Behnken响应面试验

根据最陡爬坡试验所选出的最优中心范围，通过Design Expert8软件，以最陡爬坡试验确定的中心点为中间水平，对于每个试验因素设置3个水平进行考察，设计Box-Behnken响应面试验优化HA的产量。

1.3.6 反应器放大研究

在完成了数理统计优化后，进行5L反应器的发酵试验，初步探索工艺放大。在5 L反应器中填装3 L发酵培养基，加入0.5%（V/V）的Antifoam 204消泡剂。将种子液以10%（V/V）的接种量接入，初始pH值调整为4.2，通气量为6L/min，搅拌速率设定为300 r/min，发酵温度设置为28℃。在5 L反应器发酵过程中观察发酵液的pH、菌体干质量（DCW）、残糖量、溶氧量（DO）。同时，也进行了摇瓶水平的代谢曲线研究，以比较反应器放大发酵过程与摇瓶发酵的差异。

2 结果与分析

2.1 氮源与碳源对HA产量的影响

试验研究了4种有机氮源及6种碳源对烟曲霉菌CY018发酵产HA的影响，结果见图1。由图1A可知，与其他氮源相比，牛肉膏对于烟曲霉菌的生物量积累和HA的产量效果最好。这可能是由于相比于其他氮源，牛肉膏这类复杂氮源能提供更多的营养元素[13]，适合菌体的生长和代谢[14]。除了氮源以外，碳源也参与到细胞生长，细胞组分形成，提供能量与合成代谢物[15]。由图1B可知，与其他碳源相比，添加甘露醇的培养基得到了最高的HA产量。这可能是由于甘露醇是一种缓释碳源，有利于次级代谢产物的积累[16]。可溶性淀粉不利于菌体生长和HA的积累，这可能是由于真菌较难分解利用大分子质量的碳水化合物[17]。

图1 不同氮源(A)及碳源(B)对烟曲霉酸产量的影响Fig.1 Effect of different nitrogen sources(A)and carbon sources(B) on helvolic acid production

2.2 Plackett-Burman试验

Plackett-Burman试验设计及结果见表3，采用方差分析来分析试验数据，结果见表4。由表4可知，该模型的F值为17.17且P值为0.007 7＜0.01，表明该模型极显著，且决定系数R2为0.967 8，校正决定系数R2adj为0.911 4，表示该响应方程可以为Plackett-Burman试验的提供合适的模型。试验的精确度以变异系数（variation coefficient，CV），CV值越低，表明试验的可靠性越高，设计试验中的CV=2.75%，说明实验结果可信[18]。甘露醇及牛肉浸膏对HA的合成显示了极显著的影响（P＜0.01），硝酸钠对HA的合成显示了显著的影响（P＜0.05），其他因素对HA的合成无显著的影响。该结果证实氮源与碳源对烟曲霉菌CY018发酵制备HA起到了很大的作用[19]。在测试的7种因素中，Na2C2O4对HA的产量呈现了正效应，甘露醇、硝酸钠与牛肉浸膏等其他因素呈现出负效应。根据这一结果，选择甘露醇，硝酸钠与牛肉膏这三种因素进行下一步的优化。

表3Plackett-Burman试验设计与结果Table 3 Design and results of Plackett-Burman experiments

表4Plackett-Burman试验结果方差分析Table 4 Variance analysis of Plackett-Burman experiments

2.3 最陡爬坡试验

据Plackett-Burman试验筛选出的3个显著性因素（甘露醇，硝酸钠与牛肉浸膏），通过最陡爬坡试验来寻找合成HA的培养基各因素的最优范围。由于甘露醇，硝酸钠以及牛肉浸膏均对HA的合成呈现出负效应，因此将3种因素的添加量按照递减的顺序设计最陡爬坡试验，试验的设计及结果见表5。

由表5可知，在第2组爬坡梯度中（甘露醇42.5 g/L，硝酸钠2.5 g/L，牛肉浸膏3.75 g/L）得到了最高的HA产量65.8mg/L，说明这一组添加水平已经最接近于HA合成曲面的最高值。因此，将这一组添加水平作为之后Box-Behnken试验的中心点。

表5 最陡爬坡试验设计及结果Table 5 Design and results of steepest ascent experiments

2.4 Box-Behnken响应面试验

根据最陡爬坡试验找到的最优中心范围，用软件Design Expert 8设计了3种显著性因素的Box-Behnken响应面试验，因素编码水平见表6，试验设计及结果见表7。

表6Box-Behnken试验设计因素与水平Table 6 Factors and levels of Box-Behnken experiments

表7Box-Behnken试验设计及结果Table 7 Design and results of Box-Behnken experiments

采用Design Expert 8软件对表7试验结果进行多重回归分析，得到了关于HA产量（Y）的拟合二次多项式模型方程如下：

Y=+61.21-2.71×A-2.12×B+2.05×G-2.63×A×B+1.34×A× G+1.94×B×G-4.51×A2+2.75×B2-0.63×G2

根据试验的数据，采用F-test来评估了方差分析模型的数据显著性，得到的F值为8.91，P值为0.004 4＜0.05，表示方程具有显著性。甘露醇、NaNO3、牛肉浸膏这三个因素的P值分别为的0.012 6，0.013 8，0.016 2，均＜0.05，说明该试验研究的因素均已经达到了显著差异水平。试验的信噪比为11.231＞4，表示该模型具有足够的信号[20]。模型决定系数R2为0.919 7，表示在该响应面内有91.97%的变异性可以用此多项式方程进行描述[21]，说明该模型可以用来分析预测烟曲霉菌CY018发酵产HA的量。

为了更直观的理解各因素对HA产量的影响，并获得最优的培养基组合，使用DesignExpert8软件获得了二次方程的三维响应面及等高线，结果见图2。

图2 甘露醇、硝酸钠及牛肉浸膏添加量交互作用对烟曲霉酸产量影响的响应面及等高线Fig.2 Response surface plots and contour line of effects of interaction between mannitol,sodium nitrate and beef extract addition on helvolic acid production

根据软件的预测结果，当培养基中3种因素添加量分别为甘露醇39.88 g/L，硝酸钠2.25 g/L，牛肉膏3.54 g/L时，预测的HA最高产量能达到67.53 mg/L。

2.5 响应面优化试验验证

为了验证HA产量拟合方程的最优化预测结果，采用优化后的培养基进行了3次发酵，得到的HA平均产量为68.49 mg/L，与67.53 mg/L的预测值仅相差1.42%，证明了Box-Behnken响应面试验设计的有效性，该数据模型能准确的预测HA的产量。相比于最初的发酵水平，培养基优化后HA产量达到了原先的4.1倍。

2.6 反应器放大

在优化发酵培养基的基础上进行了摇瓶水平和5 L反应器水平的发酵，以比较两种培养条件下菌体发酵的差异。在发酵的过程中记录两者的发酵参数。摇瓶及5 L反应器水平的代谢曲线见图3。

图3 摇瓶(A)及5 L反应器(B)水平烟曲霉菌发酵生产烟曲霉酸的代谢曲线Fig.3 Metabolism curves ofAspergillus fumigatusfermentation for helvolic acid production in shake flask(A)and 5 L bioreactor(B)

由图3可知，相比于摇瓶，5 L反应器中菌体生长更快，DCW在发酵的第72小时就达到了14.15 g/L。这可能是由于反应器中更好的传质效果和供氧。摇瓶和反应器中都在第144小时检测到了HA，这表示烟曲霉菌在从对数生长期进入到稳定期时开始合成HA。反应器中的HA产量在第168小时（第7天）达到了最高值54.81 mg/L。这可能是由于曲霉真菌次级代谢受到氧化应激所调控[22]，而5 L反应器中有更充足的供氧水平，抑制了HA的合成积累。

5 L反应器与摇瓶水平发酵液中残糖的消耗与菌体生长曲线均呈现了一定的相关性。当菌体生长进入了稳定期，残糖的消耗速度减缓，此时的残糖消耗可能是用于维持菌体以及次级代谢产物的合成积累。在第216小时，发酵液中的残糖基本消耗完全，此时生物量下降，表明烟曲霉菌开始自溶。同时，发酵液中的HA浓度也开始降低，这可能是由于残糖耗尽后菌体开始分解次级代谢产物来维持菌体自身。

5 L反应器与摇瓶水平的发酵液pH在发酵的过程中总体逐步提升，这可能是由于氮源的持续消耗和氨根离子的释放[23]。DO值在发酵早期快速下降，利于菌体的快速生长[24]。在菌体生长进入稳定期后，菌体只需要维持自身的生理需求，所以DO值达到稳定。

3 结论

本实验进行了烟曲霉菌CY018发酵生产HA的培养基优化和初步放大探索。通过数理统计方法优化培养基后，将HA的产量提高到了68.49 mg/L，为基础培养基的4.1倍。优化后的摇瓶发酵培养基为：甘露醇39.88 g/L，硝酸钠2.25 g/L，牛肉膏3.54g/L，丁二酸钠8.4g/L，硫酸镁0.3g/L，硫酸亚铁0.01 g/L，磷酸二氢钾0.67 g/L。将优化后的培养基应用于5 L反应器进行发酵，得到了HA的最高产量为54.81 mg/L，为HA的放大制备进行了初步的探索。

[1]ZHAO J L,MOU Y,SHAN T J.Antimicrobial metabolites from the endophytic fungusPichia guilliermondiiisolated fromParis polyphyllavar. Yunnanensis[J].Molecules,2010,15(11):7961-7970.

[2]VENDITTIS E D,PAOLA B D,GOGLIETTINO M A,et al.Fusidic and helvolic acid inhibition of elongation factor 2 from the archaeonSulfolobus solfataricus[J].Biochemistry,2002,41(50):14879-14884.

[3]KILDGAARD S,MANSSON M,DOSEN I,et al.Accurate dereplication ofbioactive secondarymetabolitesfrom marine-derived fungi byUHPLCDAD-QTOFMS and a MS/HRMS library[J].Marine Drug,2014,12(6): 3681-3705.

[4]QIN L,LI B,GUAN J,et al.In vitrosynergistic antibacterial activities of helvolic acid on multi-drug resistantStaphylococcus aureus[J].Nat Prod Res,2009,23(4):309-318.

[5]YING D,XIAO J H,XIA X X,et al.Effect of oxygen supply on biomass and helvolic acid production in submerged fermentation ofCordyceps taii[J].Biochem Eng J,2013,81:73-79.

[6]WU Q,SONG Y C,XU H,et al.Medium optimization for enhanced coproduction of two bioactive metabolites in the same fermentation by a statistical approach[J].J Asian Nat Prod Res,2011,13(12):1110.

[7]KAMMOUN R,NAILI B,BEJAR S,et al.Application of a statistical design to the optimization of parameters and culture medium for α-amylase production byAspergillus oryzaeCBS 819.72 grown on gruel(wheat grinding by-product)[J].Bioresource Technol,2008,99(13):5602-5609.

[8]WEI Z H,DUAN Y Y,QIAN Y Q,et al.Screening ofGanodermastrains with high polysaccharides and ganoderic acid contents and optimization of the fermentation medium by statistical methods[J].Bioproc Biosyst Eng,2014,37(9):1789-1797.

[9]ISA N K,MAT D M.Investigation of the gibberellic acid optimization with a statistical tool fromPenicilliumvariable in batch reactor[J].Prep Biochem Biotechnol,2014,44(6):572-585.

[10]陈羽，徐威，位星.响应曲面法优化Gluconobacter melanlgenu X42培养基[J].微生物学杂志，2016，36（4）：67-70.

[11]褚冲，姚尚杰，黄钧.中心组合设计优化野葛糖化工艺[J].中国酿造，2016，35（9）：145-149.

[12]BOK S H,DEMAIN A L.An improved colorimetric assay for polyols [J].Anal Biochem,1977,81(1):18-20.

[13]SREEKANT M S,VIJAYENDRA S V,JOSHI G J,et al.Effect of carbon and nitrogen sources on simultaneous production of α-amylase and green food packaging polymer byBacillussp.CFR 67[J].J Food Sci Technol,2013,50(2):404-408.

[14]LI P T,HSIAO W L,YU R C,et al.Effect of heat shock on the fatty acid and protein profiles ofCronobacter sakazakiiBCRC 13988 as well as its growth and survival in the presence of various carbon,nitrogen sources and disinfectants[J].Food Microbiol,2013,36(2):142-148.

[15]THAPA L P,LEE S J,YANG X G,et al.Co-fermentation of carbon sources byEnterobacter aerogenesATCC 29007 to enhance the production of bioethanol[J].Bioproc Biosyst Eng,2014,37(6):1073-1084.

[16]KOZLOVSKY A,ZHELIFONOVA V,ANTIPOVA T.The influence of medium composition on alkaloid biosynthesis byPenicillium citrinum [J].Appl Biochem Microbiol,2010,46(5):572.

[17]HELLIN P,ROS J M,LAENCINA J.Changes in high and low molecular weight carbohydrates duringRhizopus nigricanscultivation on lemon peel carbohydrate[J].Carbohyd Polym,2001,45(2):169-174.

[18]李志华.基于PB试验和响应面分析法对谷氨酸棒杆菌CN1021发酵培养基优化[J].中国酿造，2014，33（2）：23-27.

[19]ZHU Y P,LI X T,TENG C,et al.Enhanced production of α-glucosidase inhibitor by a newly isolated strain ofBacillus subtilisB2 using responsesurfacemethodology[J].Food Bioprod Proc,2013,91(3):264-270.

[20]WANG X,BAI C,ZHANG J.Improving the mda-7/IL-24 refolding and purification process using optimized culture conditions based on the structure characteristics of inclusion bodies[J].Bioresource Bioproc, 2014,1(1):21.

[21]李亚辉，马艳弘，黄开红.蓝莓发酵酒澄清和冷稳定处理的响应面优化[J].中国酿造，2015，34（2）：126-130.

[22]刘少文，柏凡，郭春华，等.黄曲霉次级代谢的分子机制研究进展[J].饲料研究，2015（9）：9-13.

[23]ABDOUN K,WOLF K,MARTENS H.Interaction between ammonia, sodium and chloride transport across the rumen epithelium in sheep[J]. Small Rumin Res,2006,63(1-2):91-99.

[24]WANG Y H,FANG X L,LI Y P,et al.Effects of constant and shifting dissolved oxygen concentration on the growth and antibiotic activity of Xenorhabdus nematophila[J].Bioresource Technol,2010,101(19): 7529-7536.

Optimization of fermentation medium for helvolic acid production and reactor scale-up study

XU Fan,ZHU Yixiang,LU Yanhua*
(State Key Laboratory of Bioreactor Engineering,Department of Bioengineering,East China University of Science&Technology, Shanghai 200237,China)

Helvolic acid is a kind of tetracyclic triterpenoids,which shows effective antimicrobial activity and anticancer effect.On the basis of single factor experiment,the medium for marine derivedAspergillus fumigatusCY018 culture for helvolic acid production was optimized,and scale-up fermentation was studied.The optimal fermentation conditions were obtained as follows:mannitol 39.88 g/L,NaNO32.25 g/L,beef extract 3.54 g/L, Na2C2O48.4 g/L,MgSO40.3 g/L,FeSO40.01 g/L,KH2PO40.67 g/L.The optimal fermentation condition was initial pH 4.2,rotation liquid volume 50 ml/250 ml,shake speed 160 r/min,temperature 28℃for 9 d.Under the optimal condition,the yield of helvolic acid could achieve 68.49 mg/L, which was 4.1 times of the yield before optimization.The study of 5 L bio-reactor was conducted,and the maximum helvolic acid production of 54.81 mg/L was achieved in 7 d,which laid foundation for helvolic acid preparation and application.

helvolic acid;Aspergillus fumigatus;fermentation medium;optimization;reactor scale-up

TQ920.6

0254-5071（2017）04-0131-06

10.11882/j.issn.0254-5071.2017.04.028

2017-02-13

国家‘863’计划项目（2013AA092901）；生物反应器工程国家重点实验室国家重点基金（2060204）

徐帆（1990-），男，硕士研究生，研究方向为生物发酵。

*通讯作者：卢艳花（1968-），女，教授，博士，研究方向为生物工程技术在中药现代化中的应用。