犬精液品质检查技术概述

余 盼

犬精液品质检查技术概述

余 盼

精液品质是公犬繁殖性能最主要的指标之一，很大程度决定了与配母犬的受胎率。同时也是犬人工授精技术、精液低温保存技术等繁殖技术的基础。本文主要从精液的一般性状（精液量、精液颜色和精子密度）、精子活力以及形态学三个方面对犬精液品质检查技术手段进行简要概述，旨在提高犬精液品质检查技术。

犬作为宠物、工作用途以及实验动物，在国内外已经发展成为一个庞大且重要的产业。随着养犬行业的发展，犬群规模的逐年扩大以及犬育种工作的开展，对犬繁殖性能的要求也越来越高。公犬的精液质量与母犬的受胎率息息相关，通过对与精子功能和形态学密切相关多个指标的客观评价，可以提高对精液样品受孕能力的预测能力，有效地节约繁殖成本，提高受胎率。本文主要对犬精液量、精液颜色、精子密度、精子活力、精子形态学这五个方面的检测方法进行简要综述。

一、精液量

犬的射精分为三段，富含精子的第二段精液决定了精液的授精能力，因而一般主要收集第二段精液进行检测分析。精液的产生与睾丸的体积密切相关，不同品种的犬射精量区别很大。在缺少发情母犬的诱导、性刺激不足、采精过程感觉到痛苦或者其他环境因素刺激时，公犬的射精量可能很少。如果对公犬的生精能力存在疑虑，应该检查其精液样品的碱性磷酸酶的浓度。碱性磷酸酶的浓度低于5000IU/L表明射精不完全、附睾障碍或发育不全。精液量的检查一般有两种方法，体积法或重量法。体积法即在刻度集精管上读出精液量，也可以用量筒测量。重量法是指利用电子天平称量精液的重量，再除以密度1.01g/mL，算出精液体积。一般而言，犬三段射精精液总体积在10mL左右。

二、精液颜色

正常精液的颜色一般为乳白色或白色，精子密度越高，乳白色越浓，透明度相对而言就越低。精液呈水样或者乳清样，说明精子密度低；精液呈深黄色，则说明精子中可能混有尿液等杂质；精液呈粉红色或者淡红色，则表示生殖道有新鲜的创伤；红褐色精液表明生殖道有陈旧创伤；精液呈淡绿色表明精液中可能有脓液混入……总之，色泽异常的精液都不宜使用。

三、精子密度

（一）目测法

取一滴精液用压片法镜检精子密度，按照精子密度范围分为密、中、稀三级。估测法评定精子密度具有较大的主观性，误差也较大，但是易于一些条件简陋的犬舍操作。

（二）计数法

用血球计数板计算精子浓度的方法最为准确，但是操作过程也最为复杂。具体操作方法为：用移液器准确吸取50μL样品，使用3.0%氯化钠溶液0.95mL与其混合均匀，使之成为20倍的稀释精液。将备好的血球计数板用血盖片将计数室盖好，用小吸管吸取一滴于血盖片边缘，使之自行流入计数室，均匀充满，不允许有气泡或厚度过大，然后在显微镜下观察计数。犬精液密度一般为1～5亿个/mL。通常可利用血球细胞计数法对其他密度检测方法进行矫正。

（三）光电比色计

根据精子密度越大透光性越差的特点，将精液透光度与标准管进行比较，能迅速准确地测出精子浓度。具体操作为：利用分光光度计在550nm的测定波长下，读取已知浓度的精液OD值，从而分析出精子密度与OD值之间的线性回归方程，再读取待测精液的OD值即可根据标准曲线计算出精液的实际浓度。现在也有许多不同品牌的犬用便携式精子密度仪，其原理也是根据光电比色，在仪器中编写特定的计算公式，使实验操作人员能够快速测定精液密度。在实际操作过程中只需要将少量样品加入专用的比色皿卡槽，5秒钟即可读取精子密度，检测速度快，结果可靠。光电比色计的缺点是操作较为繁琐，需要制作标准曲线，计算精子密度与OD值之间的线性回归方程。便携式精子密度仪通过载入固定数学模型进行计算，测得结果误差范围较大。

（四）计算机辅助分析（computer-assisted semen analysis，CASA）法

CASA最早出现在二十世纪九十年代，是将计算机技术和精液的图像处理技术应用于精子动力学分析，对精子运动图像分析，提供精子动力学量化数据。CASA检测系统通过录像机或计算机视频技术与显微镜连接组成，快速捕捉单个精子运动轨迹，采集精子的不同运动轨迹图像并进行快速、动态处理分析，从而鉴定精液的质量。因其需要对单个精子的运动轨迹进行捕捉，在计算分析过程中，通过对捕捉精子数的计算，可以准确获得精子密度信息。实际操作过程中，只需要按照要求，将处理后的精液样品加5～10μL到预热的载玻片上，盖上盖玻片，按要求操作电脑软件分析系统，即可获得准确的精子密度以及其他的动力学信息。CASA检测系统相对于光电比色法对精子密度的计算更为准确，但是对仪器设备的要求比较高，一般适用于专门化的检测机构或实验室使用。

四、精子活力

精子活力是评价精子授精能力的重要指标之一，也是最早发现及应用最广泛的精子功能指示因子。精子对温度极为敏感，在检测过程中要严格控制精液温度。具体操作：取约5μL精液（冻精分别直接置于37℃水浴中解冻后取样）置于预热后的载玻片上加盖玻片，立即在37℃载物台上用200倍～400倍相差显微镜下观察活力，也可通过电视显微装置在荧光屏上观察活力。每样片观察3个视野，并应观察不同液层的精子的运动状态，进行全面评定。原精精子活力一般在70～90%，一段时间没有配种的种犬精子活力可能会低一点。精子活力检测最常用的方法有以下几种：

（一）目测评分法

用直线前进运动的精子数占总精子数的百分比表示，一般采用十级评分法，如精子呈直线前进运动占总数90%，则为0.9级，80%即为0.8级，依次类推。原精的精液密度大，很难区分单个精子的运动方式，影响活力评定的准确性，一般进行精子活力评定时，要将原精进行稀释，稀释后浓度约为2500万个/mL。目测法是最简单快捷的检测方法，缺点是主观性太强，对于精子受精能力预测的准确性相对较低。

（二）计算机辅助分析（CASA）法

计算机辅助分析方法允许实验人员收集到客观、准确的活精子占精液中精子的百分比，同时可以获得其运动质量的详细参数。CASA系统可以跟踪拍摄单个精子活动轨迹，采集精子不同运动轨迹图像并进行快速、动态处理分析，获得精子的常规动力学参数，包括直线速率VSL（μm/s）、曲线速率VCL（μm/s）、路径速率VAP（μm/s）、直线性LIN（%）、前向性（%）、摆动性（%）、侧摆幅度（μm/s）、直线运动精子数、曲线运动精子数等。通过对精子动力学参数的评估，计算出前进运动、非前向运动、不动精子分别占全部检测精子中的百分比，其中前进运动精子百分比即为精子活力。

CASA已经成功应用于犬多种精液的分析，鲜精、冷藏精液、冷冻精液以及获活精子的分析。然而，不同精液质量分析系统的参数设置不同，对于精子活力的测定结果有显著的差别，使得不同实验室的精子活力数据很难具备可比性，对于实验结果的分析具有较大的影响。牛和人的研究表明，一些精子运动参数与精子的授精能力密切相关，但是犬精液中这些参数与其繁殖性能的关系还有待进一步研究。

（三）精子死活染色法

一般利用伊红-苯胺黑染色判定精子死活，活精子所占精子比例即为精子活力。具体操作：使用伊红-苯胺黑染色时，先取1滴新鲜精液，滴加1滴10g/L的伊红，混匀，染色30秒后再滴加1滴100g/L的苯胺黑，混匀，染色30秒后推片，晾干。待玻片晾干后，对精子形态进行镜检。死精子头部染上红色，活精子不着色。伊红-苯胺黑也是一种广泛使用的死活染色剂，因其操作简单，能快速出检测结果而得到广泛的应用。然而，由于染料本身有一定渗透压，染色过程中没有固定这一步，可能会因为渗透压的差异，人为地增加了异常精子百分比。

五、精子形态学检查

精子形态学检测主要从精子畸形率和顶体完整率这两个方面进行检测。通过制作精子抹片，在100倍的油镜下，数100～200个精子，计算其中正常和形态异常精子数量。

精子畸形率及顶体完整率常用姬姆萨进行染色。使用姬姆萨染液进行染色时，取一滴精液滴于载玻片的一端，用边缘光滑的载玻片与有样品的载玻片呈35°夹角，将样品均匀地拖布于载玻片上，自然风干。晾干后用甲醛溶液固定15分钟后用清水缓缓冲去固定液，吹干或自然风干，随后将固定好的抹片置于姬姆萨染液中染色1.5h后用清水缓缓洗去染液，晾干镜检。

正常优良种犬至少有80%以上的形态正常的活精子。当形态正常的精子比例低于60%时，公犬的繁殖力将会受到显著影响。热应激、炎症反应、中暑以及生殖道感染、促黄体素的减少、睾酮的分泌都会引起精子形态学的异常。健康的犬换到一个新环境也会短时间出现精子畸形率升高，可能是内源性肾上腺皮质素的分泌引起的。要注意的是，冻精的染色需提前去除精液稀释液，因冻精稀释液中的甘油、卵黄会与大部分固定液发生作用，从而影响精子的染色效果。

六、其他检测技术

精子在获得受精能力前会发生一系列的生理生化、分子和代谢的变化，除了以上几项检测技术，还可以利用生物化学手段、分子生物学等技术进行检测，包括精液pH测定、精子耗氧量测定、精液的细菌学检查以及利用荧光染色对精子线粒体功能、顶体完整性、精子获能状态、细胞内钙离子浓度、精子核染色质结构等进行分析。这些检测技术有助于对精子生物学以及精子低温损伤进行更深入地了解，在其他动物的精子结构和功能上的研究较多，对犬精子授精能力的重要性还需要进一步研究确定。

七、小结

鲜精或冻精的评价要点有所不同。鲜精更多地反映了公犬睾丸及副性腺的功能，冻精精液品质则更多地体现了在低温处理过程中引起的细胞损伤。精液在低温保存过程中会诱导产生精液渗透压、化学和机械压力的变化，导致一些精子的严重损伤甚至死亡，使得解冻后精液的存活时间和授精能力大大受限。通过对解冻后精液品质进行评估能够对稀释液、降温过程等实验操作进行客观准确的评价，有利于犬精液低温保存技术的成熟。我国犬的遗传育种起步较晚，发展相对滞后，建立一套可操作性强的标准化精液质量检测技术将极大地促进我国养犬业的发展。

（作者单位：公安部南昌警犬基地，330100）

（编辑：李 冰）

项目来源：国家重点研发计划“犬猫生殖调控技术研究及产品研发”，项目编号2016YFD0501008