十二味菝葜颗粒质量标准研究Δ

胡春晓，庞建云，汪小涵，沈成英，袁海龙#

(1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137； 2.空军总医院药学部，北京 100142)

十二味菝葜颗粒质量标准研究Δ

胡春晓1，2*，庞建云1，2，汪小涵1，2，沈成英2，袁海龙2#

(1.成都中医药大学药学院，四川 成都 611137； 2.空军总医院药学部，北京 100142)

目的：建立十二味菝葜颗粒的质量标准。方法：采用薄层色谱法对十二味菝葜颗粒中的菝葜、槐花、丹参、苦参进行定性鉴别；采用高相液相色谱法对菝契和土茯苓的共同有效成分落新妇苷进行含量测定，色谱柱为Inertsil©ODS-3色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，乙腈-0.1%磷酸(V∶V=16 ∶84)为流动相，检测波长为291 nm。结果：薄层色谱斑点清晰，分离度好。落新妇苷进样量在0.015 3～0.306 0 μg范围内线性关系良好(r2=0.999 9)。精密度、稳定性与重复性试验的RSD均<2%。平均回收率为100.22%(RSD为0.53%，n=6)。结论：薄层色谱法及高效液相色谱法易于操作、重复性好，可有效控制十二味菝葜颗粒的质量。

十二味菝葜颗粒； 质量标准； 薄层色谱法； 高效液相色谱法

十二味菝葜颗粒是由菝契、土茯苓、槐花、丹参、苦参等12味中药组成，是空军总医院的医院制剂(批准文号：总L2017001)，具有清热解毒、凉血散血的功能，用于血热型寻常型银屑病的治疗，亦可治疗血虚、血燥型银屑病兼有血热者。为更好地控制该制剂的质量、保证其临床疗效，本研究对方中菝葜、槐花、丹参、苦参进行薄层色谱鉴别，并采用高相液相色谱法对制剂中君药菝契和土茯苓的共同有效成分落新妇苷进行定量研究。

1 材料

1.1 仪器

AgiLent 1260型高效液相色谱仪(美国AgiLent公司)。

1.2 药品与试剂

菝葜对照药材(批号：121466-201403)、丹参对照药材(批号：120923-201414)、芦丁对照品(批号：100080-201409)、苦参碱对照品(批号：110805-200508)、落新妇苷对照品(纯度：93.9%，批号：111798-201504)，上述对照物质均购于中国食品药品检定研究院；十二味菝葜颗粒(规格：10 g/袋，自制，批号：20150504、20150505、20150506)；乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2.1 薄层色谱鉴别

2.1.1 菝葜的色谱鉴别：参考相关文献的方法[1-2]，取本品内容物3 g，加乙醇50 ml，超声处理30 min，滤过，滤液加盐酸5 ml，加热回流2 h，放冷，用40%氢氧化钠溶液调至中性，蒸至无醇味，残渣用热水40 ml溶解，用二氯甲烷振摇提取2次(40、30 ml)，合并二氯甲烷提取液，蒸干，残渣加甲醇1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取菝葜对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。按处方比例制备缺菝葜样品，同法制得阴性对照溶液。参照《中华人民共和国药典：2015年版》“通则0502”薄层色谱法，吸取上述3种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以环已烷-乙酸乙酯(V∶V=4∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇溶液，在105 ℃加热至斑点显色清晰。结果显示，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图1。

1.菝葜对照药材；2-4.供试品；5.阴性对照1.reference herb of Chinaroot Greenbier Rhizome；2-4.samples；5.negative sample图1 菝葜TLC图Fig 1 TLC chromatogram of Chinaroot greenbier rhizome

2.1.2 槐花的色谱鉴别：参考相关文献的方法[3-4]，取本品内容物1 g，加甲醇10 ml，密塞，振摇10 min，滤过，取滤液作为供试品溶液。另取芦丁对照品，加甲醇制成每1 ml含4 mg的溶液，作为对照品溶液。按处方比例制备缺槐花样品，同法制得阴性对照溶液。参照《中华人民共和国药典：2015年版》“通则0502”薄层色谱法，吸取上述3种溶液各10 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以乙酸乙酯-甲酸-水(V∶V∶V=8 ∶1 ∶1)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以10%硫酸乙醇试液显色。结果显示，供试品色谱中，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图2。

1.芦丁对照品；2-4.供试品；5.阴性对照1.reference substance of rutin；2-4.samples；5.negative sample图2 槐花TLC图Fig 2 TLC chromatogram of Sophorae flos

2.1.3 丹参的色谱鉴别：参考相关文献的方法[5-6]，取本品内容物2 g，加乙醚10 ml，振摇，放置1 h，滤过，滤液挥干，残渣加乙酸乙酯1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取丹参对照药材1 g，同法制成对照药材溶液。按处方比例制备缺丹参样品，同法制得阴性对照溶液。参照《中华人民共和国药典：2015年版》“通则0502”薄层色谱法，吸取上述3种溶液各5 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以甲苯-乙酸乙酯-甲酸(V∶V∶V=6 ∶5 ∶0.8)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以三氯化铁溶液显色。结果显示，供试品色谱中，在与对照药材色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图3。

1.丹参对照药材；2-4.供试品；5.阴性对照1.reference herb of Salviae miltiorrhizae radix et rhizoma；2-4.samples；5.negative sample图3 丹参TLC图Fig 3 TLC chromatogram of Salviae miltiorrhizae radix et rhizoma

2.1.4 苦参的色谱鉴别：参考相关文献的方法[7-8]，取本品内容物2 g，加水25 ml，超声处理30 min，滤过，取续滤液5 ml，置于分液漏斗中，加浓氨试液调节pH至11，用三氯甲烷振摇提取3次，每次20 ml，合并三氯甲烷液，置水浴后上蒸干，残渣加三氯甲烷1 ml使溶解，作为供试品溶液。另取苦参碱对照品，加三氯甲烷制成每1 ml含0.5 mg的溶液，作为对照品溶液。按处方比例制备缺苦参样品，同法制得阴性对照溶液。参照《中华人民共和国药典：2015年版》“通则0502”薄层色谱法，吸取上述3种溶液各4 μl，分别点于同一硅胶G薄层板上，以二甲苯-乙酸乙酯-丙酮-浓氨试液(V∶V∶V∶V=2 ∶4 ∶3 ∶0.2)为展开剂，展开，取出，晾干，喷以碘化铋钾试液。结果显示，在与对照品色谱相应的位置上，显相同颜色的斑点，阴性对照无干扰，见图4。

1.苦参碱对照品；2-4.供试品；5.阴性对照1.reference substance of matrine；2-4.samples；5.negative sample图4 苦参TLC图Fig 4 TLC chromatogram of Sophorae flavescentis radix

2.2 高效液相色谱法测定落新妇苷的含量

参考相关文献[9-10]，采用高效液相色谱法测定落新妇苷的含量。

2.2.1 色谱条件与系统适应性试验：色谱柱为Inertsil©ODS-3色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)；流动相为乙腈-0.1%磷酸(V∶V=16 ∶84)；流速为1.0 ml/min；检测波长为291 nm；进样量为10 μl。理论板数按落新妇苷峰计算应≥5 000。

2.2.2 对照品溶液的制备：取落新妇苷对照品适量，精密称定，加60%甲醇制成每l ml含15.3 μg的溶液，即得。

2.2.3 供试品溶液的制备：取本品约10 g，精密称定，置于圆底烧瓶中，精密加入60%甲醇25 ml，称定质量，加热回流1 h，放冷，再称定质量，用60%甲醇补足减失的质量，摇匀，滤过，取续滤液5 ml，稀释至10 ml，即得。

2.2.4 阴性对照溶液的制备：按处方比例称取除菝葜和土茯苓的其余药味，按照制备工艺制成缺菝葜与土茯苓的阴性样品，按照“2.2.3”项下供试品溶液制备方法操作，制成阴性对照溶液。

2.2.5 专属性考察：精密吸取供试品、对照品和阴性对照溶液各10 μl，注入高效液相色谱仪，按“2.2.1”项下色谱条件进行测定。结果显示，阴性对照色谱图中，在与供试品及对照品色谱图中相应的保留时间处无色谱峰出现，表明阴性对照无干扰，见图5。

A.落新妇苷对照品；B.供试品；C.阴性对照样品A.reference substance of astilbin；B.sample；C.negative sample图5 菝葜HPLC图Fig 5 HPLC chromatogram of Chinaroot greenbier rhizome

2.2.6 线性关系考察：分别精密吸取对照品溶液1、5、10、15、20 μl进样分析，记录峰面积。以峰面积(Y)对进样量(X，μg)进行线性回归，得回归方程为：Y=337.49X+1.542 8，r2=0.999 9。结果表明，落新妇苷进样量在0.015 3～0.306 0 μg范围内具有良好的线性关系。

2.2.7 精密度试验：精密吸取对照品溶液10 μl重复进样6次，测得峰面积值RSD=0.84%(n=6)，表明仪器精密度良好。

2.2.8 稳定性试验：取同一供试品溶液，分别于0、2、4、6、8、12 h进样测定。结果显示，落新妇苷峰面积值的RSD=1.37%(n=6)，表明供试品在12 h内稳定。

2.2.9 重复性试验：精密称取同一批次样品6份，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液并测定含量。结果显示，RSD=1.29%(n=6)，表明该方法重复性良好。

2.2.10 加样回收率试验：称取十二味菝葜颗粒约5 g，精密称定，精密加入一定量的落新妇苷对照品，按“2.2.1”项同法操作，测定落新妇苷的含量，计算回收率，结果见表1。

2.2.11 样品的含量测定：分别称取不同批号的十二味菝葜颗粒约10 g，精密称定，按“2.2.3”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，结果见表2。

表1 落新妇苷加样回收率试验结果

表2 落新妇苷含量测定结果

3 讨论

本实验建立的十二味菝葜颗粒中菝葜、槐花、丹参、苦参的薄层色谱鉴别法以及落新妇苷的高效液相含量测定方法，简便可行，方法学考察结果表明该方法专属性、精密度、稳定性、重复性好，可用于十二味菝葜颗粒的质量监控。本实验对三种不同类型的色谱柱进行了考察，包括Kromasil 100-5C18色谱柱、Inertsil©ODS-3色谱柱、Arcus EP-C18色谱柱，发现Inertsil©ODS-3色谱柱的分离效果及峰形最好；考察了3种流动相系统，包括乙腈-0.1%磷酸、乙腈-水、甲醇-0.1%磷酸，发现乙腈-0.1%磷酸系统基线平稳，峰形较好，落新妇苷与其他组分达到基线分离，而乙腈-水系统峰形差，甲醇-0.1%磷酸系统各峰分离度较差，故选择乙腈-0.1%磷酸系统为流动相。

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[4]孟红莲，张裕民.中药槐榆丸的质量标准研究[J].中医临床研究，2013，5(18)：38-40.

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Quality Standard for Shi’erwei Baqia ParticlesΔ

HU Chunxiao1，2, PANG Jianyun1，2, WANG Xiaohan1，2, SHEN Chengying2, YUAN Hailong2

(1.College of Pharmacy，Chengdu University of Traditional Chinese Medicine,Sichuan Chengdu 611137, China; 2.Dept.of Pharmacy, Air Force General Hospital of PLA, Beijing 100142, China)

OBJECTIVE：To establish the quality standard for Shi’erwei Baqia particles. METHDS: TLC was implemented to identify Chinaroot greenbier rhizome, Sophorae flos, Salviae miltiorrhizae radix et rhizoma and Sophorae flavescentis radix; and the common active ingredients in Chinaroot greenbier rhizome and Rhizoma smilacis glabrae was determined by HPLC method. The chromatographic column was Inertsil©ODS-3 column(250 mm×4.6 mm，5 μm), the mobile phase was acetonitrile-0.1% phosphoric acid(V∶V=16 ∶84), with detection wavelength of 291 nm. RESULTS: Diagnostic and clear spots were showed in TLC chromatogram. Astilbin showed a good linear relationship in the range of 0.015 3-0.306 0 μg(r2=0.999 9). The relative standard deviation values of precision，stability and repeatability were less than 2%. The average recovery was 100.22%(RSD=0.53%，n=6). CONCLUSIONS: The method iseasy to carry out with a good reproducibilty, and could be used to control the quality of Shierwei Baqia particles.

Shierwei Baqia particles; Quality standard; Thin layer chromatography; High performance liquid chromatography

军队医疗机构制剂标准提高科研专项(No.13ZJZ12-5)

R927.2

A

1672-2124(2017)04-0438-04

2017-02-20)

*硕士研究生。研究方向：中药新制剂、新剂型及新技术研究。E-mail：1940596849@qq.com

#通信作者：研究员，博士生导师。研究方向：中药新型给药系统。E-mail：yhlpharm@126.com

DOI 10.14009/j.issn.1672-2124.2017.04.003