治愈的肺结核患者治疗前后血清蛋白双向电泳初步比较分析

杨瑜 谢贝 吴玲 孟繁荣 王楠 雷杰 张言斌 彭德虎 谭守勇 刘志辉



·短篇论著·

治愈的肺结核患者治疗前后血清蛋白双向电泳初步比较分析

杨瑜 谢贝 吴玲 孟繁荣 王楠 雷杰 张言斌 彭德虎 谭守勇 刘志辉

选取2013年于广州市胸科医院治疗的初治肺结核，并经1个常规抗结核治疗疗程(6个月)治愈的42例患者作为研究对象，采用双向凝胶电泳技术(two dimension electrophoresis，2-DE)对研究对象治疗前、后的混合血清全组蛋白进行电泳分离，以PDQuest 8.0软件根据蛋白质点数、等电点(isoelectric point，PI)、相对分子质量(relative molecular mass，Mr)等进行差异蛋白描述性分析。结果显示，研究对象治疗前、后差异蛋白点共有15个，治疗后血清相对应差异蛋白有12个下调，3个上调，Mr为16 200～76 800，PI为5.0～6.8。由此可见，治愈的肺结核患者治疗前后血清中存在特异性的差异蛋白，差异蛋白可能作为结核病的重要诊断标志物或者治疗靶点。

结核，肺； 血清； 双向差异凝胶电泳； 蛋白质组学

常规的结核病诊断依赖影像、痰涂片和细菌培养，存在敏感度低、特异度差、耗费时间等问题。因此，寻找新的诊断标志物，建立敏感可靠的早期诊断方法，以及探讨结核病的发病机制是结核病防控和治疗的首要任务。目前，蛋白质组学技术发展迅速，已成为筛选血清标志物的有力工具[1]。本研究采用双向凝胶电泳(two dimension electrophoresis，2-DE)技术对42例临床已治愈的肺结核患者治疗前、后血清标本进行蛋白质点比较分析，旨在发现结核病相关的差异蛋白，为肺结核的早期诊断、发病机制探索、病情监测提供依据。

资料和方法

1.研究对象：选取2013年于广州市胸科医院治疗的初治肺结核，并经1个常规抗结核治疗疗程(6个月)治愈的42例患者作为研究对象，其中男25例，女17例；年龄17～78岁，平均(42.24±18.00)岁。研究对象均于抗结核治疗前、后分别留取血清，并于广州市胸科医院生物样本库保存。肺结核临床治愈的标准为：(1)临床症状好转；(2)痰中抗酸杆菌阴转；(3)胸部X线摄影或CT扫描检查显示病灶明显吸收或病灶稳定；(4)空洞闭合或明显缩小[2]。

2.试剂与仪器：双向电泳相关试剂固相pH梯度干胶条(IPG dry strip pH4-7，17 cm)、蛋白浓度测定试剂盒(Quick StarTMBradford protein assay)、两性电解质Bio-lyte 3/10、二硫苏糖醇(dithiothreitol，DTT)、考马斯亮蓝G250染料、碘乙酰胺、尿素、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺等均购自美国Bio-Rad 公司；三氯乙酸(TCA)、丙酮等为常规有机试剂。等电聚焦仪(Protean IEF cell)、垂直电泳系统(Protean Ⅱ xi cell)、投射扫描仪GS800和凝胶分析软件PDQuest 8.0均购自美国Bio-Rad公司。

3. 2-DE样品制备：为了更好地进行2-DE凝胶图片的比较分析，将研究对象治疗前、后血清分别混合成3份电泳标本，共计6份标本(每个标本含有14例患者治疗前或后的血清)，每个电泳标本加入4倍体积的体积分数为10%的冰TCA-丙酮混合液，振荡混匀，置于冰上4 h；4 ℃，12 000 r/min离心10 min(离心半径为7 cm)，弃上清，加入1 ml 体积分数为90%的冰丙酮重悬沉淀，离心，去上清，重复3次；上样水化液1 ml溶解蛋白样品。

4.样品浓度测定：根据蛋白浓度测定试剂盒说明进行蛋白样品浓度的测定。3份混合的患者治疗前血清标本的蛋白浓度分别为5.15、4.00、6.44 μg/μl；3份混合治疗后患者血清标本的蛋白浓度分别为5.03、3.39、4.62 μg/μl。

5. 2-DE：(1)第一向电泳于等电聚焦仪上进行，3组治疗前、后的样品胶上样量约为600 μg，水化和聚焦程序设置为：50 V，12 h，15 ℃(水化)；250 V线性，30 min(除盐)；1000 V 快速，1 h(除盐)；10 000 V线性，5 h(升压)；10 000 V快速，60 000 Vh(聚焦)；500 V快速，任意时间(保持)。(2)聚焦结束后，将胶条先后置于质量分数为2%的DTT和2.5%的碘乙酰胺的胶平衡液中轻摇各10 min。(3)第二向电泳于垂直电泳系统上进行，十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰氨凝胶电泳[dodecyl sulfate,sodium salt (SDS)-Polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE]胶浓度为12%，电泳条件为：50 V，30 min；300 V，5 h；每组样品重复3次。

6.SDS-PAGE胶染色：采用胶体考马斯亮蓝染色法进行凝胶染色，具体操作参考文献[3]。

7.凝胶图谱分析：应用PDQuest 8.0凝胶分析软件分析治疗前、后各份标本的蛋白质凝胶图谱，根据蛋白的等电点(isoelectric point，PI)、相对分子质量(relative molecular mass，Mr)、匹配度，确定治疗前、后差异蛋白点。蛋白质的相对表达量以灰度值表示，蛋白点表达量升高或降低3倍以上者则认为存在差异。

结 果

1．2-DE图谱的建立：通过上述方法可获得分辨率和重复率较高的血清蛋白2-DE图谱。3组治疗前、后混合配对电泳样品的匹配率分别为(75±3)%、(77±4)%和(71±4)%；凝胶图谱中清晰可辨的蛋白点数为(158±11)个，Mr分布于12 000～102 000，PI为4.2～6.8，见图1。

2．差异蛋白分析：治疗前与治疗后的血清蛋白点比较，第1个配对组有24个差异蛋白点，治疗后血清相对应差异蛋白有21个下调，3个上调；第2个配对组有31个差异蛋白点，治疗后血清相对应差异蛋白有28个下调，3个上调；第3个配对组有18个差异蛋白点，治疗后血清相对应差异蛋白有14个下调，4个上调。综合分析3个配对组治疗前后蛋白图谱，差异蛋白点共有15个，Mr为16 200～76 800，PI为5.0～6.8，治疗后血清相对应差异蛋白有12个下调，3个上调，见图1。3组治疗前后共有的差异蛋白点具体信息见表1。

图1、2为第1组患者治疗前后血清2-DE图谱；图3、4为第2组患者治疗前后血清2-DE图谱；图5、6为第3组患者治疗前后血清2-DE图谱；箭头所指为各配对组治疗前、后相对应的差异蛋白点；点1～12为3个配对组患者治疗后表达下调的共有差异蛋白点；点13～15为3个配对组患者治疗后表达上调的共有差异蛋白点图1 肺结核治愈患者治疗前后血清2-DE图谱差异分析

讨 论

血清是一种理想的生物样本，易获取，并且包含大量由病变组织释放相关蛋白的生物信息。血清蛋白的快速变化可反映疾病发展的机制。因此，在血清或血浆中极有可能寻找到结核病相关的重要诊断标志物及治疗靶点。目前，蛋白质组学在血清标志物研究上具有很大的优势[4]。已有学者通过蛋白质组学方法研究结核病患者与正常人血清蛋白的变化，发现一些与结核病相关的特异性蛋白点。Song等[5]应用纳米流动超高效液相色谱和四极杆飞行时间质谱比较分析结核病患者与正常人的血清蛋白，发现结核病患者血清α1-抗胰蛋白酶的表达较正常人高，是潜在的诊断标志物。Li等[6]通过同位素标记差异蛋白分析技术(isobaric tags for relative and absolute quantitation，iTRAQ)发现性激素结合球蛋白(sex hormone-binding globulin，SHBG)有可能是结核病诊断新的标志物。同样应用iTRAQ方法，Xu等[7]发现血清钙结合蛋白S100A9、胞外超氧化物歧化酶3(extracellular superoxide dismutase，SOD3)和基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase，MMP9)可作为肺结核诊断的新标志物，敏感度达到92.5%，特异度达到95.0%。由此可见，通过蛋白质组学技术在血清中寻找结核病早期诊断标志物是一种必然的趋势，而且能为探讨结核病发病机制或病情监测提供丰富的实验数据，但目前依赖血清标志物的简便、快速的结核病诊断方法仍未应用于临床。

表1 肺结核治愈患者治疗前后共有差异蛋白表达情况

本研究应用2-DE技术将42例治愈的肺结核患者治疗前后血清分为3组，分析其蛋白差异，差异蛋白点数分别为24、31和18。组间出现差异蛋白点数不一致，也许跟各组患者年龄、性别、病情程度，以及不同批次的凝胶电泳条件不同有关。但本研究通过随机分配及重复实验将组间差异降到最低。通过对比分析3组样品的凝胶图谱，明确患者治疗前后存在相同的15个差异蛋白点，其中，有12个蛋白质点在抗结核治疗后表达下调，3个蛋白质点在治疗后表达上调。肺结核在抗结核药物治疗后，体内结核分枝杆菌活性被抑制或杀灭，对机体组织或细胞产生免疫刺激减少，因此，这也许是治疗后部分蛋白表达下调的原因。下调的蛋白点可能为治疗肺结核的重要靶点及生物标志物。而治疗后表达上调的蛋白或许是细胞在疾病进展过程中调节分泌的重要信号蛋白，上调的蛋白点可能为治疗结核病的保护蛋白或耐药蛋白。

同时还发现15个差异蛋白的Mr为16 200～76 800，PI为 5.0～6.8。有的差异蛋白相对分子质量相同，但PI不同，这种现象反映了这些蛋白有可能来源于同一前体蛋白，其只是同一前体蛋白通过不同的修饰作用后而得到的不同产物，而且这些来源于同一前体蛋白的几种蛋白有可能共同参与了宿主或结核分枝杆菌的某一生命活动。这跟笔者之前应用基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(matrix-assisted laser desorption ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF-MS)对16例肺结核患者治疗前后蛋白的研究有相似发现[8]。

另外，本研究标本为治愈的肺结核患者治疗前后的血清，换言之，治愈后的血清即为正常人的血清，因此，本研究不仅明确了肺结核患者治疗前后血清蛋白的差异，同时表明肺结核患者与正常人的血清蛋白存在差异，这与之前的研究结论相同[9]。

总之，本研究表明肺结核患者治疗前后血清蛋白凝胶图谱存在明显差异。这些差异蛋白点可能为结核病的重要诊断标志物或者治疗靶点。但本次实验仍有不足之处，尚未对这些差异蛋白点进行鉴定，且样本量少。因此，下一步实验计划将通过MALDI-TOF-MS或iTRAQ-LC-MS质谱技术，获取差异蛋白序列，并通过蛋白免疫印迹法(Western blot)在蛋白水平及通过RT-PCR在基因水平进行验证，以进一步对差异蛋白的结构和功能做出评价。

[1] 张霞, 张宗德, 李琦. 结核病的体液蛋白质组学研究进展. 中华结核和呼吸杂志, 2013, 36(3): 207-209．

[2] 屠德华, 万利亚, 王黎霞. 现代结核病控制理论与实践. 2版. 北京: 军事医学科学出版社, 2013:152-153.

[3] 郭葆玉. 基因组学与蛋白质组学实验技术及常见问题对策. 北京: 人民卫生出版社, 2010: 249-251．

[4] Ray S, Reddy PJ, Jain R, et al. Proteomic technologies for the identification of disease biomarkers in serum: advances and challenges ahead. Proteomics, 2011, 11(11): 2139-2161.

[5] Song SH, Han M, Choi YS, et al. Proteomic profiling of serum from patients with tuberculosis. Ann Lab Med, 2014, 34(5): 345-353.

[6] Li C, He X, Li H, et al. Discovery and verification of serum differential expression proteins for pulmonary tuberculosis. Tuberculosis (Edinb), 2015, 95(5): 547-554.

[7] Xu D, Li Y, Li X, et al. Serum protein S100A9, SOD3, and MMP9 as new diagnostic biomarkers for pulmonary tuberculosis by iTRAQ-coupled two-dimensional LC-MS/MS. Proteomics, 2015, 15(1): 58-67.

[8] 尹小毛, 刘志辉, 刘玉美, 等. 肺结核患者强化治疗前后血清差异蛋白质质谱分析. 临床肺科杂志, 2010, 15(5): 697-698.

[9] 刘志辉, 刘玉美, 云径平, 等. 结核病患者和正常人血清蛋白质双向凝胶电泳差异比较. 广东医学, 2008, 29(12): 1991-1993.

(本文编辑：李敬文)

Preliminary comparative analysis of serum proteins from cured pateints with pulmonary tuberculosis before and after treatment by two dimension electrophoresis

YANGYu,XIEBei,WULing,MENGFan-rong,WANGNan,LEIJie,ZHANGYan-bin,PENGDe-hu,TANShou-yong,LIUZhi-hui.

LungDiseaseInstituteofGuangzhouChestHospital,Guangzhou510095,China

Correspondingauthor:LIUZhi-hui,Email:liuyixi2005@163.com

A total of 42 new tuberculosis (TB) cases seeking health care in Guangzhou Chest Hospital in 2013 were enrolled in this study. All the patients were cured after 6-month first-line anti-TB regimen. The two-dimensions electrophoresis (2-DE) was performed to separate the whole blood protein of patients at the initial and end of treatment, respectively. In addition, the isoelectric point (PI) and the relative molecular mass (Mr) were determined by PDQuest 8.0 software. Our results revealed that there were 15 protein spots exhibiting different profiles between these two periods. In addition, the expression levels of 12 protein spots of the post-treatment period were significantly higher than those of the pre-treatment period, while 3 protein spots were significantly decreased after anti-TB treatment. TheMrvalues of these proteins ranged from 16 200-76 800, and the PI values were from 5.0-6.8. On the basis of our findings, there were specific differential serum proteins in the cured tuberculosis patients before and after treatment. The differential proteins might serve as important diagnostic markers or therapeutic targets of TB.

Tuberculosis, pulmonary; Serum; Two-dimensional difference gel electrophoresis; Proteomics

10.3969/j.issn.1000-6621.2017.03.023

广州市科技计划项目(2014Y2-00117、155700012)；广东省科技计划项目(2013B021800060)

510095 广州市胸科医院肺部疾病研究所(杨瑜、谢贝、吴玲、孟繁荣、王楠、雷杰、刘志辉)，结核内科(张言斌、彭德虎、谭守勇)

刘志辉，Email：liuyixi2005@163.com

2016-09-06)