响应面法优化大豆11S蛋白谷氨酰胺转氨酶改性工艺参数

李风光,李军生，阎柳娟，黄国霞

(1.广西科技大学 生物与化学工程学院，广西 柳州 545006； 2.广西糖资源绿色加工重点实验室，广西 柳州 545006； 3.广西高校糖资源加工重点实验室，广西 柳州 545006)

油料蛋白

响应面法优化大豆11S蛋白谷氨酰胺转氨酶改性工艺参数

李风光1,2,3,李军生1,2,3，阎柳娟1,2,3，黄国霞1,2,3

(1.广西科技大学 生物与化学工程学院，广西 柳州 545006； 2.广西糖资源绿色加工重点实验室，广西 柳州 545006； 3.广西高校糖资源加工重点实验室，广西 柳州 545006)

采用响应面法优化酶交联反应条件，制备高乳化性大豆11S蛋白。以酶添加量(以50 mL样液为参照)、大豆11S蛋白质量浓度、温度和pH为自变量，以乳化性为响应值，利用单因素实验和响应面法对高乳化性大豆11S蛋白制备条件进行优化。结果表明，最佳反应条件为酶添加量22 U(50 mL大豆11S蛋白溶液)、大豆11S蛋白质量浓度26.5 g/L、温度47℃、时间2 h、pH 8.0。在最佳反应条件下，乳化性为76.13%，模型的预测值为76.89%，实验值与预测值相差0.76个百分点，拟合模型具有良好可靠性。未改性大豆11S蛋白乳化性为60.00%，改性后其乳化性提高16.13个百分点。

响应面法；大豆11S蛋白；谷氨酰胺转氨酶；酶交联改性

大豆中含有蛋白质约40%[1]，由脱脂大豆粉经过碱溶酸沉等方法可制备大豆分离蛋白(SPI)[2]。采用等电点高速离心法可将大豆分离蛋白分离成2S、7S、11S、15S(S为沉降系数)4种球蛋白组分[3]，其中2S和15S组分约13%，而7S组分约35%，11S组分约52%[4]。大豆分离蛋白中含有18种常见氨基酸[5]，营养价值相当高，经过进一步的提纯后可直接作为一种食品。由于球蛋白在稳定自身结构的过程中将疏水性基团包埋在蛋白质内部，从而使得大豆分离蛋白的乳化性等受到限制[6]。大豆分离蛋白中蛋白质含量高达93.1%[5]，乳化性能较差。大豆11S蛋白作为大豆分离蛋白中主要组分，使得对其进行改性修饰具有很大的空间。

谷氨酰胺转氨酶是一种能够促使蛋白质分子间和分子内酰基发生转移的生物酶，能使赖氨酸残基和谷氨酸残基间形成ε-(γ-谷氨酰) 赖氨酸共价键[7]，该键的形成能促使蛋白质分子间和分子内的肽链间发生交联，生成具有优良凝胶性能的网络状超大蛋白质分子，有效提高蛋白质的起泡性、乳化性、溶解性、热稳定性等功能性质，进而改善食品蛋白质的质构、外观和风味，被誉为“2l世纪超级黏合剂”，是一种在食品工业上应用广泛的酶制剂[8]。杨春华[9]通过对高去酰胺碱性蛋白酶与转谷氨酰胺酶复合改性大豆11S球蛋白的研究发现，改性后的11S球蛋白乳化性提高了11.3%。杨淼等[10]研究不同油相比例的转谷氨酰胺酶对大豆分离蛋白乳液凝胶性能的诱导影响，得出提高油相比例时凝胶的持水性有显著提高。从而说明谷氨酰胺转氨酶能在一定程度上提高大豆分离蛋白的乳化性能。

本实验采用响应面法对酶交联改性反应条件进行优化，分析酶添加量、大豆11S蛋白质量浓度、pH、温度4个因素对响应值乳化性影响的变化规律，确定酶交联改性制备高乳化性大豆11S蛋白的最佳工艺参数，为其进一步的开发应用提供参考。

1 材料与方法

1.1 实验材料

脱脂大豆粕，购自安阳得天力食品有限公司；谷氨酰胺转氨酶(40 U/g)，购自南宁庞博生物工程有限公司；金龙鱼大豆调和油，购于谭中超市；其他试剂均为分析纯。

JJ200电子天平，PHS-250W pH计，J-26XPI Bechman Coulter高速冷冻离心机，YFD2000中型冷冻干燥机，DHG-9123A 电热恒温鼓风干燥机，HZ-9201K台式恒温振荡器，DF-101S集热式恒温磁力搅拌器，100LX 高剪切混合乳化机。

1.2 实验方法

1.2.1 大豆11S蛋白的制备

采用Samoto等[5]方法稍作修改。称取5 000 g脱脂大豆粉(低脂大豆粕粉碎过60目筛，70℃干热处理2 h)，配成料液比1∶10的样品溶液。用2 mol/L NaOH溶液调整溶液pH至8.0，25℃条件下搅拌2 h。在15℃、5 000 r/min条件下离心10 min，弃去沉淀，上清液中加入1 mol/L的Na2SO3溶液5 mL使上清液中Na2SO3浓度约为1 mmol/L,再用2 mol/L HCl溶液调整pH至5.8，在15℃、5 000 r/min条件下离心10 min，所得沉淀即为大豆11S蛋白，沉淀冷冻干燥备用。

1.2.2 谷氨酰胺转氨酶催化大豆11S蛋白交联工艺流程

大豆11S蛋白→ 0.2 mol/L磷酸缓冲液溶解→加酶→200次/min振荡反应→ 85℃灭酶→改性大豆11S蛋白。

1.2.3 改性大豆11S蛋白乳化性测定

取5 mL样液于25 mL蒸馏水和20 mL大豆油混合液中，在10 000 r/min条件下乳化1 min，将乳化液倒入乳化管中，静置60 min后观察乳化层高度。乳化性计算公式为[11]：

乳化性=乳化层高度/液体总高度×100%

2 结果与分析

2.1 大豆11S蛋白改性单因素实验

2.1.1 酶添加量对大豆11S蛋白乳化性的影响

利用 0.2 mol/L 磷酸缓冲液(pH 7.0)配制25 g/L 大豆11S蛋白溶液50 mL，分别添加 0、12、16、20、24、28 U谷氨酰胺转氨酶，反应混合物于 50℃下反应 2 h，反应后 85℃灭活 15 min。测定乳化性，结果如图1所示。

图1 酶添加量对大豆11S蛋白乳化性的影响

由图1可以看出，随着酶添加量的增加，乳化性逐渐提升，当酶添加量为20 U时，乳化性达到最大值74.04%，酶添加量大于20 U时乳化性有所下降。因此，实验将酶添加量的考察范围定为16～24 U。

2.1.2 大豆11S蛋白质量浓度对大豆11S蛋白乳化性的影响

利用0.2 mol/L 磷酸缓冲液(pH 7.0)分别配制0、15、20、25、30、35 g/L的大豆11S蛋白溶液50 mL，谷氨酰胺转氨酶添加量为20 U，反应混合物于 50℃下反应 2 h，反应后85℃灭活15 min。测定乳化性，结果如图2所示。

图2 大豆11S蛋白质量浓度对大豆11S

由图2可以看出，随着大豆11S蛋白质量浓度的增加，乳化性逐渐提升，当质量浓度为25 g/L时乳化性达到最大值74.51%，当质量浓度超过25 g/L时乳化性有所下降。因此，实验将大豆11S蛋白质量浓度的考察范围定为20～30 g/L。

2.1.3 温度对大豆11S蛋白乳化性的影响

利用 0.2 mol/L 磷酸缓冲液(pH 7.0)配制25 g/L 的大豆11S蛋白溶液50 mL，谷氨酰胺转氨酶添加量为 20 U，反应混合物于温度40、45、50、55、60℃下反应2 h，反应后 85℃灭活 15 min。测定乳化性，结果如图3所示。

图3 温度对大豆11S蛋白乳化性的影响

由图3可以看出，随着温度的升高乳化性不断增加，当温度达到45℃时乳化性达到最大值75.92%，当温度超过45℃时乳化性有较明显的下降趋势。因此，实验将温度的考察范围定为40～50℃。

2.1.4 pH对大豆11S蛋白乳化性的影响

利用pH 分别为6.0、6.5、7.0、7.5、8.0的0.2 mol/L磷酸缓冲液配制25 g/L的大豆11S蛋白溶液50 mL，谷氨酰胺转氨酶添加量为 20 U，反应混合物于50℃下反应 2 h，反应后 85℃灭活 15 min。测定乳化性，结果如图4所示。

图4 pH对大豆11S蛋白乳化性的影响

由图4可以看出，随着pH的增加乳化性呈上升趋势，当pH为7.5时乳化性达到最大值77.36%，pH超过7.5后乳化性有所下降。但pH为8.0时乳化性高于pH 7.0之前的乳化性。因此，实验将pH的考察范围定为7.0～8.0。

2.2 大豆11S蛋白改性响应面优化实验

2.2.1 响应面实验设计及结果

在单因素实验的基础上，固定时间为2 h，确定酶添加量(A)(以50 mL样液为参照)、大豆11S蛋白质量浓度(B)、温度(C)、pH(D)4个因素水平，以乳化性(Y)为响应值，依照Box-Behnken中心组合实验设计原理[12-15]，采用四因素三水平响应面进行实验。每组实验重复3次，取其平均值为实验结果。响应面因素及水平见表1，实验设计方案及结果见表2。

表1 响应面因素及水平

表2 实验设计方案及结果

续表2

实验号ABCDY/%140-10-169.00150-10175.0016000074.0417011064.7118000074.5119-100-168.3720001166.0021000074.5322-1-10071.0023-110072.0024010175.9625110072.6426000074.762710-1071.1528100176.4729-10-1071.15

2.2.2 响应面二次回归模型建立及分析

利用Design-Expert V8.0.5.0软件对表2数据进行多元回归拟合，以乳化性为响应值，得到模拟方程如下：

Y=-131.756 71+0.444 69A+0.063 167B+

5.429 5C+17.633D-0.001 125AB+0.001 312AC+0.010 937AD+0.006 95BC+0.033 25BD-0.012 75CD-0.013 013A2-0.011 853B2-0.058 828C2-1.062 83D2

对上述模型有效性进行方差分析，结果见表3。

由表3还可以看出，C、D、A2、B2、C2、D2对Y值的影响极显著(P<0.01)，BC影响显著(P<0.05)，其他因素影响不显著。通过比较各变量P值可知，各因素对改性大豆11S蛋白乳化性的影响从大到小排序为温度>pH>酶添加量>大豆11S蛋白质量浓度。

由响应面分析可知，回归模型存在最大值点编码值(-0.000、0.423、-0.045、1.000)，最大值点对应的模型各因素反应条件为酶添加量21.66 U、大豆11S蛋白质量浓度26.65 g/L、温度47.09℃、pH 8.0，在该条件下响应面预测的乳化性为76.89%。

表3 回归模型方差分析

注：**为极显著,P<0.01；*为显著，P<0.05。

2.3 最佳条件下的验证实验

为了验证模型的可靠性，对响应面优化条件进行验证实验，考虑到实际实验操作的可行性，将最佳条件优化为酶添加量22 U(以50 mL样液为参照)、大豆11S蛋白质量浓度26.5 g/L、温度47℃、pH 8.0、时间2 h。同时对比测定改性前后大豆11S蛋白的乳化性，结果见表4。

表4 改性前后大豆11S蛋白的乳化性对比测定结果

由表4可以看出，改性前大豆11S蛋白的乳化性平均值为60.00%，改性后其乳化性平均值为76.13%，模型预测值为76.89%，乳化性比改性前的提高16.13个百分点，同时与预测值相差0.76个百分点。验证实验表明，该模型较好地预测了改性大豆11S蛋白制备过程中乳化性的情况，且谷氨酰胺转氨酶改性处理后大豆11S蛋白的乳化性有很大程度的提高。

3 结 论

利用谷氨酰胺转氨酶对大豆11S蛋白进行酶交联改性，以乳化性为响应值，通过四因素三水平Box-Behnken 响应面法，建立了乳化性的二次多项式回归模型方程。回归方程拟合效果较好，可以利用该方程预测谷氨酰胺转氨酶对大豆11S蛋白进行改性后的乳化性。

通过响应面优化实验所得最佳工艺条件为酶添加量22 U(以50 mL样液为参照)、大豆11S蛋白质量浓度26.5 g/L、温度47℃、时间2 h、pH 8.0。在最佳条件下，乳化性的预测值为76.89%，实际测定值为76.13%，二者相差0.76个百分点，预测值与实际值拟合性良好。未改性大豆11S蛋白乳化性测定值为60.00%，改性后其乳化性提高16.13个百分点。

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Optimization of modification process parameters of soybean 11S protein by glutamine transaminase using response surface methodology

LI Fengguang1,2,3, LI Junsheng1,2,3, YAN Liujuan1,2,3, HUANG Guoxia1,2,3

(1.Faculty of Biological and Chemical Engineering,Guangxi University of Science and Technology,Liuzhou 545006,Guangxi,China; 2.Guangxi Key Laboratory of Green Processing of Sugar Resources, Liuzhou 545006,Guangxi,China; 3.Key Laboratory for Processing of Sugar Resources of Guangxi Higher Education Institutes,Liuzhou 545006,Guangxi,China)

Enzyme crosslinking reaction conditions were optimized by response surface methodology to prepare high emulsibility soybean 11S protein.With dosage of enzyme(50 mL sample solution as reference), mass concentration of soybean 11S protein, temperature and pH as independent variables, and emulsibility as response value,the preparation conditions were optimized by single factor experiment and response surface methodology. The results showed that the optimal preparation conditions were obtained as follows: dosage of enzyme 22 U(50 mL soybean 11S protein solution), mass concentration of soybean 11S protein 26.5 g/L, temperature 47℃, time 2 h, and pH 8.0.Under the optimal conditions,the emulsibility was 76.13%, the model predictive value was 76.89%, and the error between experimental value and predictive value was 0.76 percentage points, which showed a good reliability of fitting model. The emulsibility of modified protein increased by 16.13 percentage points compared with unmodified soybean 11S protein with emulsibility 60.00%.

response surface methodology；soybean 11S protein；glutamine transaminase；enzyme crosslinking modification

2016-06-01;

2016-10-14

国家自然科学基金项目(21466006)；国家科技型中小企业技术创新项目(14C26214502814)；广西科学研究与技术开发计划项目(桂科能1412009-3-3，桂科转14125006-30)；广西高等学校高水平创新团队及卓越学者计划资助(桂教人(2014)7号)

李风光(1989)，男，硕士研究生，研究方向为生物分子化学修饰(E-mail)m13788325731_2@163.com。

李军生，教授，硕士生导师(E-mail)junshenglee63@aliyun.com。

TQ936.2;Q51

A

1003-7969(2017)02-0093-05