国内外软籽石榴研究进展

罗华　郝兆祥　侯乐峰　王庆军　马敏

摘要：介绍了国内外软籽石榴种质资源，对国内外软籽石榴相关研究成果进行了综述，包括种质资源与创新利用、分子生物学、种子硬度与生理生化、栽培等，分析了国内外软籽石榴研究利用存在的问题并进行了展望，以期为今后开展相关研究等提供借鉴和参考。

关键词：软籽石榴；研究进展；问题；展望

中图分类号：S665.4-1 文献标识号：A 文章编号：1001-4942（2017）04-0157-07

Research Progress of Soft-Seed Pomegranate in Domestic and Foreign

Luo Hua， Hao Zhaoxiang， Hou Lefeng， Wang Qingjun， Ma Min

（Zaozhuang Pomegranate Research Center of Shandong Province， Zaozhuang 277300， China）

Abstract The soft-seed pomegranate germplasm resources in the world were briefly introduced in the paper. The related research achievements were summarized including germplasm resources and their creative utilization， molecular biology， seed hardness， physiology and biochemistry， cultivation， etc. The problems present in research and utilization of soft-seed pomegranate in domestic and foreign were also analyzed and prospected. It was aimed to provide references for future research.

Keywords Soft-seed pomegranate； Research progress； Problem； Prospect

石榴（Punica granatum L.）属石榴科（Punicaceae）石榴属（Punica L.）植物[1]，是集经济、生态、社会效益以及观赏、保健功能于一体的优良落叶果树，愈来愈引起世界各国的重视[2]。石榴种子硬度是其鲜食品质的重要指标之一[3]，而石榴中的软籽品种，其种子退化、变软，与硬籽石榴比较，食之无渣、适口性强、容易吞咽，结束了吃石榴吐渣的历史，可食率高，亦适宜加工[4]，是石榴中的珍品，生产与消费市场潜力巨大。发展软籽石榴可以有效促进我国农业增效、农民增收、农村发展[5]。

1 研究进展

1.1 种质资源与创新利用

软籽石榴抗旱性較强，在干旱和半干旱气候地区也能很好生长[6]。但其抗寒性、抗病性等较弱，栽培区域不够广泛[7]，种质资源也比较稀缺。目前，以色列、土库曼斯坦、美国、土耳其、突尼斯、意大利、伊朗、印度、西班牙、墨西哥、中国等国家，均有为数不多的软籽石榴种质资源保存和利用[8]。

以色列软籽石榴品种主要有‘Emek、‘Akko、‘Shani-Yonay、‘Malisi、‘P.G. 127-28等，另外还有‘Rosh Hapered、‘Black、‘Acco等甜型品种；‘Hershkovich、‘P.G.131-32等酸甜型品种；‘P.G.116-17等酸型品种[8]。其中，‘Akko、‘Shani-Yonay为早熟品种，鲜果主要出口[9]，‘Black为极晚熟品种[8]，‘Emek为实生选种获得[10]；‘Malisi栽植数量较少[11]。

土库曼斯坦软籽石榴品种主要有‘Medovyi Vasha、‘Myatadzhy、‘Sirenevyi、‘Parfianka、‘Gissarskii、‘Myagkosemyannyi Rosovyi、‘Ariana、‘Molla Nepes、‘Azadi、‘Desertnyi、‘Gissarskii Rozovyi、‘Vkusnyi[12，13]。

美国加州大学戴维斯分校国家石榴种质资源库（NCGR）保存的软籽石榴品种主要有‘Sin Pepe、‘Medovyi Vahsha、‘Myatadzhy、‘Sirenevyi、‘Parfianka、‘Gissarskii、‘Myagkosemyannyi Rosovyi、‘Ariana、‘Molla Nepes[13]。其中，‘Sin Pepe、‘Medovyi Vahsha、‘Myatadzhy三个品种种子极软；‘Sin Pepe为本地品种；‘Desertnyi、‘Vkusnyi、‘Medovyi Vahsha、‘Myatadzhy、‘Sirenevyi、‘Parfianka、‘Gissarskii、‘Myagkosemyannyi Rosovyi、‘Ariana、‘Molla Nepes引自土库曼斯坦[12]；‘EverSweet引自黎巴嫩[12]；另外，还有一些商业化的软籽石榴品种‘California White、‘Fleischman、‘Sin Pepe、‘Utah Sweet（本地品种）、Fleischman（美国人Paul H. Thomson选育并命名）。

土耳其软籽石榴品种主要有‘Wonderful 16，为酸甜型品种，品质优良，另外，还有‘OG7、‘OG13、‘TA15、‘Fellahyemez、‘Kus Nari、‘01 N 05 Devedisi Ⅰ、‘07 N 01 ekirdeksiz Ⅰ、‘07 N 06 Devedisi Ⅱ、‘07 N 13 ekirdeksiz Ⅲ、‘07 N 15 ekirdeksiz Ⅳ、‘33 N 10 ekirdeksiz Ⅱ、‘33 N 26 ekirdeksiz Ⅵ、 ‘ekirdeksiz （Alanya）等甜型品种；‘TA2、‘TA8、‘TA22、‘zmir-23等酸甜型品种；‘OP9等酸性品种[14-16]。

意大利植物育种家Ferdinando Cossio博士还选育出一个种子极软的石榴品种‘Angel Red（Smith），堪称‘无籽石榴。

伊朗软籽石榴品种主要有‘Bihaste Dane Sefide Ravar（BDSR）、‘Bihaste Sangan（BS）、‘Bihaste Shirin Saravan（BSS）、‘Bihaste Hajiabad（BH）、Bihaste-Ravar（BR）、Bihaste-Najafabad（BN1）、 Bihaste-Neyriz（BN2），均保存于亚兹德石榴保存中心。7个品种假种皮均为白色，属甜型品种[17，18]。

印度软籽石榴品种主要有‘Ganesh、‘Jyoti、‘Bedana、‘Mridula、‘Bhagwa、‘Ruby。其中，‘Ganesh是从硬籽品种‘Alandi实生苗中选出，主要用作杂交育种亲本[19-21]，‘Ruby是经杂交育种获得{[（‘GaneshבKabul）בYercaud]-F2}×{（‘GaneshבGul Shah Red）-F2}[10]；‘Mridula（甜型）和‘Bhagwa鲜果主要出口到欧洲[22]。

西班牙软籽石榴品种主要有‘Mollar de Elche，为地方品种[11]。

墨西哥软籽石榴品种主要有‘Tecozautla，籽粒深红色，甜型，为地方品种，另外，还有‘34-20、‘Jereuaro、‘34-15等品种[23]。

突尼斯的石榴栽培品种较多，但从国内外文献上看，仅发现关于‘突尼斯软籽石榴的报道。

1986年前中国没有软籽石榴种质资源；1986年后通过赠送、引种驯化、自主培育等，现有‘突尼斯软籽石榴、‘红如意、‘红双喜、‘红玉软籽、‘紫美、‘中农红软籽6个软籽石榴品种、种质。其中，‘突尼斯软籽石榴被广泛栽培。2013年3月，河南省洛阳市农林科学院从以色列引进‘以色列1、2、3号，以及‘以色列M、Y号5个软籽石榴品种[24，25]。最近几年，从以色列、土耳其、美国等国家引进若干软籽石榴品种，极大丰富了我国软籽石榴种质资源。最近10年，有极少数实生软籽石榴苗木进入生产领域，必将有个别具有特异性状的实生软籽石榴树被保存下来，也将丰富中国的软籽石榴种质资源。

1.2 分子生物学研究

1.2.1 遗传多样性研究 AFLPs涉及到DNA序列差异，因此AFLP技术理论上对于评价不同基因型之间的关系时会更加精确和可靠[26，27]。Ali通过形态学标记和荧光AFLP分子标记两种标记手段，得出的两种石榴品种的分组结果，其相关性不显著（r=-0.36）[28]，与Talebi[26]和Zamani[27]等的研究结果一致，可能是由于环境和栽培措施影响所导致。两种标记分组不一致的结果与Rotondi[29]、Uma[30]、Hagidimitriou[31]在其它经济作物上的研究一致。另外，转录后影响和非细胞核遗传也有可能导致不一致情况[32，33]。突变导致的形态指标差异在RAPD及其它分子标记的结果中并没有体现出来[17，34-36]。建议用SNPs（单核苷酸多态性）和ESTs（表达序列标签）来精确描述伊朗软籽石榴品种间的异同点可能会更加有效[17]。

1.2.2 功能基因研究 连红可通过GFP报告基因的遗传转化试验，初探GFP的瞬时表达情况，但未有效区分转基因愈伤，分析可能是因为愈伤组织中不含叶绿素，其在紫外光激发下，发出的光为淡黄色和淡绿色，与转基因材料相似[37]。李跃霞研究得出，浓度为OD600=0.5的农杆菌菌液侵染叶片愈伤10 min為最佳侵染条件[38]。郭晓丽针对‘突尼斯软籽抗寒能力差的情况，将抗寒基因CBF转入‘突尼斯软籽愈伤，得到抗寒新种质—转基因抗性苗[39]。曹丹琴等从石榴中克隆出PgMYB转录因子基因，通过比较‘突尼斯软籽等3个石榴品种中PgMYB的表达情况，推测该基因可能抑制石榴种皮中木质素的生物合成[40]。

Abdolkarim以软籽品种BR和硬籽品种TZ为研究对象，分离并鉴定细胞壁形成相关基因，同时研究随果实发育进程，木质素生物合成相关基因、纤维素代谢相关基因的表达情况。两品种的苯丙氨酸氨裂解酶基因（PAL）、咖啡酰氧辅酶-A-氧甲基转移酶基因（CCOMT）、咖啡酸氧甲基转移酶基因（COMT）、肉桂醇脱氢酶基因（CAD）的表达水平变化趋势相似。硬籽品种中肉桂酰辅酶A还原酶基因（CCR）和CAD的表达水平高于软籽品种；软籽品种中COMT的表达水平高于硬籽品种。两品种的纤维素合酶基因（CelSy）、蔗糖合成酶基因（SuSy）的表达水平变化趋势相似，且都表现为软籽品种的表达水平高于硬籽品种。两品种的吲哚-1，4-β-葡聚糖酶基因（Egase）表达水平均随果实发育进程逐渐降低，在花后20、40天时，硬籽品种的EGase表达量分别为软籽品种的5倍、2倍，之后，硬籽品种的EGase表达量开始急剧降低，与软籽品种无显著差异。两品种的查尔酮合成酶基因（CHS）表达水平均维持平稳，且无显著差异[41]。吲哚-1，4-β-葡聚糖酶（Egase）是细胞壁形成的关键酶类，在细胞壁降解过程中起作用[42]。Egase在纤维素生物合成中起重要作用，该酶类通过与纤维素合酶复合物（CSCs）进行物理连接，造成纤维素微纤丝组织相关基因缺陷，继而能够降低成熟植物的纤维素水平[43]。开始阶段，两品种的籽粒均表现为软籽状态，但到后期，只有硬籽品种的籽粒开始硬化，硬化时间在40～60天之间，60天时两品种籽粒硬度差别已经很大[44]。各生长发育时期，硬籽品种的木质素含量均显著高于软籽品种，软籽品种的纤维素含量均显著高于硬籽品种，推测木质素和纤维素在石榴籽粒的细胞壁结构中起互补作用[41]。

1.2.3 蛋白组学研究 曹尚银应用差异蛋白组学技术，从蛋白水平上探究了石榴果实发育成熟期果皮的代谢进程。运用双向电泳和MALDI-TOFTOFMS 质谱鉴定技术研究‘中农红软籽和‘三白果实成熟时果皮蛋白质组学差异，结果表明，细胞色素b6-f复合体、叶绿素a/b结合蛋白和果糖激酶2-like可能与果皮颜色变化相关；半胱氨酸合酶1可能对提高石榴的抗氧化胁迫能力起重要作用，为今后石榴果实发育蛋白质组学研究及果实品质改善提供了一定的理论依据[44]。

1.2.4 胞粉研究 ‘突尼斯软籽石榴存在明显的花粉直感效应。‘突尼斯软籽ב豫大籽、‘突尼斯软籽ב三白座果率较高；‘突尼斯软籽ב黑籽甜、‘突尼斯软籽ב陕西大籽果实品质较好；突尼斯ב豫大籽、‘突尼斯ב黑籽甜种子硬度较小。试验结果为‘突尼斯软籽石榴生产合理配置授粉树、提高果实品质提供了依据[45]。

1.2.5 胚培养研究 胚培养属于无性繁殖手段，是提高胚成苗率、避免胚退化、打破休眠、缩短育种周期的重要手段，可在多倍体研究上应用。陈延惠等以‘突尼斯软籽石榴叶片、幼胚为外植体，得出了最佳培养条件及最佳分化、生根等组培配方。张晓申、何宁等对‘突尼斯软籽石榴幼茎的组培快繁技术进行了研究，也得出了最佳增殖、生根等组培配方[46-49]。

1.3 种子硬度与生理生化研究

按石榴种子软硬分类，是在石榴种子“非常软”和“非常硬”之间划分若干等级，然后依据软硬度进行分类[50]。国内外有四分法和三分法之分。国内安广池等[51]、国外Zarei等[52]持四分法观点；国内巩雪梅[53]，国外Melgarejo等[4]、Martinez等[54]持三分法观点。安广池等划分标准：软籽（种子硬度0～4.5 kg）、半软籽（种子硬度4.6～7.5 kg）、普通硬籽（种子硬度7.6～10.5 kg）、硬籽（種子硬度>10.6 kg）四类[51]。Zarei等通过研究软籽和硬籽品种的种子破碎压力值，将石榴品种分成四类：软籽（80～150 N）、半软籽（200～220 N）、半硬籽（300～420 N）和硬籽（450～630 N）[52]。巩雪梅划分标准：软籽（种子硬度<3.67 kg/cm2）、半软籽（种子硬度3.67～4.2 kg/cm2）、硬籽（种子硬度>4.2 kg/cm2）三类[53]；Melgarejo等利用石榴种子中纤维含量、品尝小组嘴嚼感觉，将石榴品种分为软籽、半硬籽、硬籽三类[4]。另外，种子干重也可以作为衡量种子硬度的一个重要参数[54]。

石榴种子的硬质部分富含纤维、脂肪酸、多糖和矿物质。除构成纤维的树胶、黏胶层、半纤维素、多糖、果胶等成分外，纤维素和木质素含量也十分丰富，且决定了种子的硬度[4]。种子硬质部分约占整个籽粒鲜重（包括假种皮硬质内层、胚、子叶）的7%～22%[4，54，55]。硬质内层的厚壁组织对种子硬度起决定性作用[56]。

石榴种子的硬质部分主要由木质素聚合而成[50]。木质素有3种单体，即对香豆醇（p-coumaryl alcohols）、松柏醇（coniferyl alcohols）和芥子醇（sinapyl alcohols）。因单体不同，木质素分羟苯基（H）、愈创木基（G）和紫丁香基（S）3种类型[57]。籽粒硬度与木质素含量呈正相关，相关系数为0.906[40，58]。

陆丽娟等研究发现，石榴软籽性状不仅不同品种间差异显著，而且同一品种、同一树体不同部位种子硬度差异水平极显著，其中树体北面及内膛果实种子较软，南面与西面果实种子较硬，东面果实种子硬度居中[59]。有研究和生产者提出，不同授粉品种、不同砧木对石榴种子硬度也有一定影响，但未见报道。

Zarei等研究发现，随果实发育进程，软、硬籽品种中超氧化物歧化酶（SOD）活性均一直下降，而硬籽品种在最后阶段升高。漆酶（LAC）活性一直升高，软籽和硬籽品种间无显著差异。苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性均一直下降，且软籽品种弱于硬籽品种。所有品种籽粒中木质素含量一直升高。总酚含量大幅降低，抗氧化活性缓慢升高，两者显示出相反的趋势，推测存在两个反应，对同样底物的需求存在竞争效应。在最后阶段，过氧化物酶（POD）活性显著高于LAC，推测POD对于石榴种子中木质素聚合可能有更重要的作用，且可能对石榴种子软化过程起作用。S和G类型木质素之间比率的不同可能是石榴籽粒柔软程度不同的主要原因[18]。

Ali研究了21个石榴品种（4个软籽品种）的营养特征指标。结果显示，抗氧化活性范围为64.54%～75.12%，100 g鲜重（FW）的有机酸含量在16.50～22.66 mg之间，花青素指数（果汁稀释4倍）在0.83～1.94之间，100 g干重（DW）的假种皮中酚类含量在12.60～18.97 mg之间，100 g干重的果皮中酚类含量在50.73～103.83 mg之间。木质素含量指数[wpi，wpi=（籽粒质量-外种皮质量）/籽粒质量[4]]在5.37%～14.13%之间，其中4个软籽石榴品种的wpi为5.376%～6.230%，BDSR品种的wpi最低[17]，wpi和100 gfw之间呈极显著负相关。在一些西班牙石榴品种中，wpi范围为6.145%～9.68%[54]。

Ali还研究了上述21个石榴品种的数量性状和质量性状。研究发现， TA和EC、TA和TSS均呈极显著正相关，抗氧化活性和VC含量呈显著正相关，抗氧化活性和假种皮中的没食子酸含量呈显著正相关。假种皮长度和百粒重呈显著正相关，这些结论能够为今后石榴品种选育工作提供重要借鉴。以种子长度、宽度和果汁、假种皮等种子相关性状为主要因子，利用主因子进行聚类分析，将21个品种分成4类，种子软硬、假种皮和果实大小是分组的主要性状[60]。

Sarikhani以‘Torsh-e-Zabol（TZ，硬籽）、‘Malas-e-Yazdi（MY，半硬籽）、‘Zagh-e-Yazdi（ZY，半软籽）、BDSR 4个石榴品种为研究对象，研究种子生长模式和纤维素聚合模式。研究发现石榴果实生长阶段分两个，第一阶段种子达到最大尺寸并开始发生纤维聚合。第二阶段胚开始生长，种子干物质开始迅速增加。TZ的假种皮重量、种子鲜重和干重、木质素含量指数均最高，BDSR的上述四个指标均最低。硬籽品种种子中纤维素的质量百分比最高，软籽品种中最低[56]。石榴种子大小约在六月中旬达到最大值（座果后第28天），但纤维聚合过程需要持续到约座果后第56天。TZ的纤维聚合过程处于座果后第14～42天，而BDSR开始于座果后第7天，并缓慢持续到果实成熟[56]。通过解剖学研究也证明，BDSR的纤维聚合程度最低。巧合的是，在波斯语中，“Bihast”的含义即为“软籽”。

1.4 栽培研究

與硬籽石榴品种相比，‘突尼斯软籽石榴抗寒性很弱，气温低于-10℃超过半天即可发生冻害。秦岭-黄河（河南段）-苏鲁省界以北的地区为不适宜栽培区，黄河（河南段）以南至淮河以北为次适宜区。在次适宜栽培区引种栽植须采取防寒措施方可保证软籽石榴树安全越冬[61]。‘突尼斯软籽石榴半致死温度及抗寒性明显低于峄城三白甜、峄城青皮岗榴、临潼净皮甜、宁津青皮酸、太行红等硬籽品种[62，63]。

范春丽等以5～8年生的河阴酸石榴、红皮石榴、白石榴为砧木，高枝嫁接‘突尼斯软籽石榴，冬季低温过后，‘河阴酸、‘突尼斯软籽石榴之砧穗组合存活率最高[64]。杨雪梅等认为石榴的抗寒性不能通过任何单一指标来确定，隶属函数法作为一种模糊数学统计方法，可以将多个抗性指标的隶属度进行综合比较来评价品种间的抗性[65]。姚方等研究证明，不同软籽石榴抗寒能力依次为：‘以色列3号> ‘突尼斯> ‘以色列1号> ‘以色列2号>‘中农红>‘以色列M>‘以色列Y[24]。聂琼等研究证明，将‘突尼斯软籽石榴引种到湖南栽培，其花粉活力比北方稍高，说明其能够适应湖南高温多湿气候，但其座果率低等问题还需要进一步研究、解决[66]。南京地区每年初夏受锋面雨带影响，进入梅雨季节，雨季约20 d，梅雨过后，天气晴燥，常会形成伏旱，对软籽石榴开花坐果及果实生长有一定影响，表现为完全花比例低、座果率不高、果实外观品质欠佳等问题[67]。

由此可见，引种地区的气候条件是软籽石榴引种时需要慎重考虑的问题。

2 存在问题与展望

种质资源是育种的物质基础和基因资源利用的前提。但国内外软籽石榴种质资源数量比较匮乏。与此同时，石榴从起源地传播至不同国家和地区，相同基因型的品种在不同国家有可能获得了不同的命名[11]，除个别品种系人工杂交获得外，很多品种并不知其起源与亲缘关系[68]。‘Wonderful系列软籽品种在美国、以色列、土耳其、智利、南非、秘鲁等国家栽培较多，但其种仁硬度有差异；埃及的早熟品种‘Granada与美国的‘Granada非常相似，“同品种异名、异品种同名”现象普遍存在。这给软籽石榴种质资源的收集保存、创新利用等带来了极大不便。

与硬籽石榴相比，软籽石榴不仅品种资源数量少，而且基础研究薄弱，品质育种工作进展缓慢。国内外红色、甜型软籽石榴品种大多抗性差、籽粒风味寡淡、果实不耐贮藏、适采期短，有的品种大小年结果现象比较严重。‘Ganesh是印度著名的软籽石榴品种，种仁极软，品质较好，但果实较小，通过疏果才能够使其单果重达到350 g，且果实近成熟时裂果严重，品质育种有待加强。亚洲以及中东等国家消费者比较喜欢甜型、酸甜型软籽石榴品种；欧洲以及以色列等国家消费者比较喜欢酸甜型软籽石榴品种；而美国、澳大利亚等国家消费者则比较喜好酸型品种。因此，在选育软籽石榴新品种时，应针对不同消费群体设定不同的育种目标[20]。

在世界范围内，软籽石榴栽培是一个新兴产业，预计未来10年将步入快速稳步发展时期。随着石榴分子生物学的发展及分子生物技术的进步，分属于不同国家和地区的软籽石榴种质基因库建立；其遗传多样性、逆境胁迫、生理习性、生态适应性、成花机理、引种栽培、遗传育种等研究取得较大进展；种质资源不断丰富；抗逆性强、适应性广、丰产性好、风味酸甜、综合品质优良的软籽石榴优良品种不断出现；栽培技术日趋成熟、科学、可行、可靠。

我国适宜栽培软籽石榴的地域较广、土地较多，有众多的组织者、生产者、研究人员、消费者的关注与努力，中国很有希望成为世界软籽石榴生产大国和强国。

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