锯末牛粪堆肥微生物多样性的宏基因组学分析

王慧丽+江娟

摘要：运用宏基因组技术研究不同比例锯末牛粪堆肥产物中微生物的组成和分布。结果表明，牛粪与锯末质量比为2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1的3个堆肥样本中微生物可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）有较大的差异，其中含量最高的3个门的微生物为变形菌门、拟杆菌门和厚壁菌门，在不同样本中它们的含量也有较大差异。从属水平分析，含量最高的是甲基单胞菌属、噬氢菌属、固氮菌属和寡养单胞菌等营养转化和合成的菌属。降解纤维素和木质素的也有一定的含量，特别是假单胞菌属含量较高。经过对堆肥产物基本性质及其微生物的分析发现，当牛粪与锯末的比例为2 ∶1时，堆肥样品中的营养转化和合成菌属以及去除污染菌属都高于其他2个样品，堆肥效果较好。

关键词：牛粪堆肥；宏基因组；微生物；锯末；可操作分类单元（OUT）；分子生态学依据

中图分类号： S141.4文献标志码： A文章编号：1002-1302（2017）07-0028-05

近年来，由于产业结构调整，我国规模化养殖业发展迅速。以生产牛奶为主的奶牛养殖业产生了可观的经济效益，但是同时也带来了大量的牛粪等固体有机废弃物，为了保护环境、实现养殖业的可持续发展，必须进行牛粪的无害化处理和资源化利用，堆肥处理是目前有机固体废物处理的重要方式。堆肥的本质是微生物群落结构演替协同作用于堆肥基质的生化过程[1-2]。在细菌和真菌等微生物的作用下，降解有机物，杀死病原菌，促进有机质稳定化和腐殖化，最终达到无害化和资源化的目的，并生成大量可被植物吸收利用的有效态氮、有效态磷、有效态钾化合物和其他有机物质作为土壤肥力活性物质。因此，研究微生物的群落结构对于了解微生物的协同关系、调控堆肥以及研究高效稳定的复合菌系都有重要意义。堆肥过程中的微生物菌系复杂，变化较大，而且其中大多数菌系不能分离培养，因而常规的试验方法和手段难以完全认识和真实反映微生物的群落组成[3-4]。宏基因学技术分析克服了传统微生物分析仅限于可分离培养组分的缺陷，通过对样品中微生物基因序列的分析，可以快速确定微生物的种类和丰度，主要采用16S rDNA序列分析进行微生物的群落分析检测出样品中大量的低丰度生物。目前，宏基因组学技术已经应用于海洋、土壤、石油以及人体胃肠道等多个方面[5-7]，但用于堆肥研究的较少。在牛粪堆肥中，通常以农作物秸秆、木质、锯末废弃物等作为辅料，起到加速堆肥过程和保证堆肥效果的作用[8]。本研究就地取材，在牛粪中添加不同比例的锯末，采用宏基因组学技术对不同比例锯末添加产生的微生物进行对比分析，旨在明确堆肥微生物的群落组成，合理评价堆肥效果，为堆肥工艺研究应用提供一定的分子生态学依据。

1材料与方法

1.1堆肥试验及样品采集

试验所用的牛粪和锯末分别从湖南省武汉市南湖养殖场和永宏木材加工厂收集（锯末作为调节剂）。堆肥试验在实验室内进行，以锯末为调理剂，与牛粪充分混合后进行堆肥试验，设置柱体高度为0.8 m，直径为0.5 m，实行人工翻堆通气，每3 d进行1次手工翻堆。在3个相同的堆肥容器内，将牛粪与锯末分别按照2 ∶1、3 ∶1、4 ∶1比例混合，堆肥45 d时取样，分别在每个柱体的上、中、下采集样品，然后将3个取样点的样品混合为1个样品，3个堆肥容器所取的样品分别编号为1、2、3号样品。

1.2宏基因组DNA的提取和16S rDNA测序

对3个样本采用MIO-BIO的PowerSoil DNA Isolation Kit进行基因组DNA抽提，分别取3 μL进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。

根据illumina Miseq高通量测序要求，进行双向测序，设计16S V4～V5区域和带有5′Miseq接头-barcode-测序引物-特异引物-3′的融合引物。细菌16S V4～V5引物序列如下：515F，5′-AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC-

NNNNNNNN-TCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCTGTGC

CAGCMGCCGCGGTAA-3′；926R，5′-CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT-NNNNNNNN-GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCACCGTCAATTCMTTTGAGTTT-3′。文库构建采用2步PCR扩增的方法：首先采用特异引物扩增目的片段，将目的片段进行胶回收，而后将回收产物作为模板进行二次PCR扩增，目的是将illumina平台测序所需的接头、测序引物和barcode添加到目的片段的两端。将PCR扩增产物电泳检测效果好的样品于2%琼脂糖凝胶电泳切胶回收，取 3 μL 回收产物进行电泳检测。PCR产物采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒进行回收，微量荧光核酸定量仪和Qubit 3.0试剂进行定量，均一化混匀后送样到上海微基生物公司测序。

1.3数据分析方法

1.3.1测序获得序列的质量控制在试验过程中，测序产物可能含有非特异性扩增片段，利用特异性引物信息可以将其去除；序列中可能含有模糊碱基、单碱基高重复区以及PCR过程中产生的一些嵌合体，将这些序列纳入分析范围会降低分析质量，因此去除此部分序列，可得到供精准分析的优化序列。

1.3.2可操作分类单元（operational taxonomic units，OTU）分析首先提取非重复序列，碱基完全一致序列为重复序列只保留1条；然后与SILVA v119数据库（http：//www.arb-silva.de/）中的aligned（16S/18S，SSU）核糖体序列比对[9]，使用uchime软件检测PCR扩增中产生的嵌合体序列（Chimeric序列）并去除嵌合體序列；最后使用mothur V.1.33.3软件进行距离计算与OTU聚类分析[10]。OTU是在系统发生学或群体遗传学研究中为了便于分析，人为给某一个分类单元（品系、属、种、分组等）设置的同一标志。要了解一个样品测序结果中的菌种、菌属等数目信息，就须要对序列进行聚类操作（cluster）。通过聚类操作，将序列按照彼此的相似性分归为许多小组，1个小组就是1个OTU。可根据不同的相似度水平，对所有序列进行OTU划分，通常在97%的相似水平下对OTU进行生物信息统计分析。在进行OTU分类学分析时，首先将每一条优质序列都与数据库进行比对，找出其最相近且可信度达80%以上的种属信息；之后将每一个OTU中的所有序列进行类比，找出同一OTU中不同序列的最近祖先的种属信息。将OTU综合分类表中的信息按照门、纲、目、科、属、种6个水平分别提取信息，分别统计各样品在不同分类水平上的相对丰度。

1.3.3分级发育树在前述分类学分析中，已经得到每个OTU的丰度和对应的分类学信息，使用软件MEGAN（http：//ab.inf.uni-tuebingen.de/software/megan/）導入分析数据中样品包含的物种及物种丰度[11]，通过交互式搜索NCBI的分类数据库信息，以树状图形式表现物种的丰度情况和群落结构，反映微生物的组成情况。这种方法构建的系统树不同于利用序列碱基差异构建的系统发育树，不能反映物种间的时间进化信息。

1.3.4系统发生进化树在分子进化研究中，系统发生的推断能够揭示出有关生物进化过程的顺序，了解生物进化历史和机制，可以通过序列间碱基的差异构建进化树。选择OTU的代表序列根据邻位比对法（neighbor-joining）使用MEGA软件构建进化树，结果以列图或者圈图的形式呈现。

2结果与分析

2.1堆肥样品基本性质

针对堆肥初始和堆肥45 d后的混合料及渗滤液进行基本的性质检测，包括混合料的含水率、pH值、碳氮比，渗滤液的CODCr（化学耗氧量）和BOD5（生化耗氧量）去除率。同时，在堆肥45 d后提取稀释液，注入无菌去离子水，加入适量浸泡后的种子，在培养箱中28 ℃培养1周，观察种子发芽率，具体数值见表1和表2。

初始堆肥料的含水率在55%～65%之间，被认为是比较适合堆肥发酵的条件[12]。因此，1号样可能有较好的发酵条件（表1）。通过表2可以看出，在堆肥45 d后，3个样品均达到了基本腐熟化，种植发芽率均>50%。1号样中渗滤液CODCr和BOD5的去除率、种子发芽率较高。

2.2宏基因组DNA的提取

DNA提取是微生物种群分析的先决步骤，提取纯度将影响后续的试验和分析。试验对3个样本进行基因组DNA抽提后，分别取3 μL进行1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果见图1-A。其中，从上至下条带依次为9 000、5 000、3 000、2 000、1 000、500 bp，上样量为3 μL，亮带为30 μg/uL，其余条带均为10 ng/μL，基因组条带可见，后续试验根据浓度加入 5～50 ng进行后续PCR扩增试验。

二次PCR扩增后PCR产物的琼脂糖凝胶电泳检测结果如图1-B所示，由此可见，二次PCR扩增后条带单一，亮度适中，可进行后续胶回收试验。将PCR扩增产物电泳检测效果好的样品，于2%琼脂糖凝胶电泳切胶回收，取3 μL回收产物进行电泳检测。检测结果（图1-C）显示，PCR产物回收效果良好。

2.3样本微生物群落OTU分布

通过MiSeq测序，1、2、3号样分别获得了34 317、34 128、35 180条细菌的16S rDNA序列。利用双端测序的成对序列（pair end reads）间的重叠部分将成对序列拼接成1条序列，拼接好的全部样本序列长度统计主要分布在400～450 bp之间。

通过OTU分析可以获得不同样本中微生物群落的种属信息，笔者测序的3个样本总共获得了3 677个OTU类别，3个样本分别获得的OTU数目为1 631、1 867、1 899个，不同样本间的交集如图2所示。

OTU是根据宏基因组测序中的序列信息来获得可能的物种分类信息，一般属水平的OTU居多。1号样在变形菌门（Proteobacteria）有较多的OTU分布，2号样在拟杆菌门（Bacteroidetes）有较多的OTU分布；3号样在变形菌门（Proteobacteria）有1个OTU，是3个样本所有OUT中含量中最高的，这个OTU是嗜甲基菌科（Methylophilaceae），这是一种利用甲醇和甲胺为唯一碳源和能源的革兰阴性杆菌，主要在活性污泥中[13]，这可能与3号样中牛粪含量较高有关。

在这些不同的OTU中发现了一些有潜在功能并且和堆肥过程或肥料肥力相关的微生物类别，如能降解纤维素的细菌噬纤维菌科（Cytophagaceae）在3个样本中的丰度分别为0.008 5、0.006 4、0.001 6，特别是噬纤维菌目（Cytophagales）在1号样中达到1%。已报道的可以降解木质素的细菌中厌氧梭菌（Clostridium）和假单胞菌属（Pseudomonas）都有一定的含量[14]，其中厌氧梭菌菌株Clostridium sp. enrichment culture clone VanCtr97在3个样本中的含量分别为0.001 9、0002 3、0.001 3；假单胞菌属（Pseudomonas）在3个样本中的含量更是高达0.034 1、0.008 2、0.014 9。假单胞菌属是重要的解脂肪菌，能溶解矿物质，提供养分供应[14-15]，因此假单胞菌属是堆肥产物肥力的重要组成部分。此外，其他营养转化和合成相关的细菌[15]，如亚硝化单胞菌（Nitrosomonas sp.）、非共生固氮固氮螺菌（Azospirillum sp.）和共生固氮根瘤菌（Rhizobium sp.）在各个样本中都有一定的比例，从 0.000 1～0.008不等。

2.4样本微生物种群门和属水平分布

种属信息按照分类学水平分为多列，将物种的门、纲、目、科、属、种6个水平的信息及相关的其他分类信息的全部内容都进行分类分析。样品间可以通过基于群落组成的层次聚类分析（bray-curtis算法）进行相似度树分析（图3）。从图3可以看出，其中门水平含量最多的5个细菌门类及其在1、2、3号等3个样本中的比例分别是：变形菌门（Proteobacteria），0.694、0.386、0.555；拟杆菌门（Bacteroidetes），0.174、0.389、0.202；厚壁菌门（Firmicutes），0.034、0.067、0.083；螺旋菌门（Spirochaetae），0.017、0.049、0.030；放线菌门（Actinobacteria），0.016、0.013、0.050。并且这3个样本在含量最多的3个门类细菌的比例上都有较大差别。门是非常大的分类单元，须要进行属水平的比较小而常用的分类单元的细菌分类比较，但是有很多序列不能确定到具体的属中，3个样本分别有42%、70%、58%的OTU不能确定到属的水平。

已知属信息的OTU中按丰度排序的前50个OTU分布如图4所示，其中能确定属类别的OTU中含量最高的5个属及其比列分别是：甲基单胞菌属（Methylomonas），0.019、0.022、0.049；噬氢菌属（Hydrogenophaga），0.036、0.018、0.025 9；固氮弧菌属（Azoarcus），0.069、0.006、0.003；固氮捲菌属（Azonexus），0.004、0.007、0.033；寡养单胞菌（Stenotrophomonas），0.043、0.003、0.002。这5个都属于变形菌门，其中固氮弧菌属和固氮捲菌属都属于红环菌科的固氮菌属。这5个含量最高的属都是属于营养转化和合成的菌属，如甲基单胞菌属能利用甲烷、甲醇等含甲基的单碳化合物为碳源和能源，寡养单胞菌可以降解有机农药，并且同时将农药转化为生物活性更高的代谢产物[16]。

2.5样本微生物群落分类学系统树分析

将测序得到的物种丰度信息回归至NCBI数据库的分类学系统关系树中，可以从整个分类系统上全面了解测序的环境样品中所有微生物的进化关系和丰度差异，图5是对已知属信息的前50个属类别进行分类学分级进化树分析结果。从图5可以看出，2号样的变形菌门（Proteobacteria）含量比1、3号样少，其中的α、β、γ变形菌纲都是如此，但是2号样的δ变形菌纲细菌丰度反而是最高的。黄单胞菌科（Xanthomonadaceae）在1号样中所占比列稍多，但是在黄单胞菌科下属的寡养单胞菌属（Stenotrophomonas）中1号样大大超过其他2个样本之和，而同是黄单胞菌科下属的沙单胞菌（Arenimonas）则在1号样中基本没有，更为极端的是两面神菌属（Janibacter）和甲烷氧化菌甲基弯曲菌属（Methylosinus）等菌属基本上只在3号样中存在。

3结论

本研究通过对不同比例牛粪和锯末进行堆肥试验，采用宏基因组技术检测堆肥后混合料的微生物组成。3个样的种子发芽率都在50%以上，可见堆肥样品基本完全腐熟，可直接作为肥料使用，各种基本性质稍有差别。3个样品的微生物种群都比较丰富，说明微生物之间有良好的协同关系；在3个样品中门水平含量最多的5个细菌门类分别是变形杆菌、拟杆菌、壁菌门、螺旋菌门和放线菌门，其属水平含量最多的是甲基单胞菌和固氮菌等营养转化和合成的菌属。降解纤维素的微生物随着锯末所占比例的减少而减少，1号样中的营养合成菌属包括甲基单胞菌属、噬氢菌属、固氮菌属和寡氧单胞菌，其含量均高于2、3号样，说明1号样肥力更高，同时1号样中噬纤维菌科比例较高，可见堆肥已经充分腐熟。1号样中的寡氧单胞菌比例较高，也印证了1号样的CODcr和BOD5去除率较高。因此，牛粪与锯末的比例为2 ∶1的堆肥效果要优于3 ∶1、4 ∶1。

参考文献：

[1]卢秉林，王文丽，李娟，等. 牛粪与小麦秸秆混合高温堆肥的腐熟进程研究[J]. 环境污染与防治，2010，32（1）：30-34.

[2]魏彦红，郁继华，颉建明，等. 不同添加剂对牛粪高温堆肥的影响[J]. 甘肃农业大学学报，2012，47（3）：52-56，61.

[3]牛俊玲，高军侠，李彦明，等. 堆肥过程中的微生物研究进展[J]. 中国生态农业学报，2007，15（6）：185-189.

[4]王晶，许修宏. 利用PCR-DGGE方法研究添加复合菌剂对堆肥微生物群落的影响[J]. 农业环境科学学报，2011，30（12）：2602-2607.

[5]孙欣，高莹，杨云锋. 环境微生物的宏基因组学研究新进展[J]. 生物多样性，2013，21（4）：393-400.

[6]Handelsman J，Rondon M R，Brady S F，et al. Molecular biological access to the chemistry of unknown soil microbes：a new frontier for natural products[J]. Chemistry & Biology，1998，5（10）：R245-R249.

[7]Chistoserdova L. Recent progress and new challenges in metagenomics for biotechnology[J]. Biotechnology Letters，2010，32（10）：1351-1359.

[8]张军，雷梅，高定，等. 堆肥調理剂研究进展[J]. 生态环境，2007，16（1）：239-247.

[9]Quast C，Pruesse E，Yilmaz P，et al. The SILVA ribosomal RNA gene database project：improved data processing and web-based tools[J]. Nucleic Acids Research，2013，41（D1）：D590-D596.

[10]Schloss P D，Westcott S L，Ryabin T，et al. Introducing mothur：open-source，platform-independent，community-supported software for describing and comparing microbial communities[J]. Applied and Environmental Microbiology，2009，75（23）：7537-7541.

[11]Huson D H，Auch A F，Qi J，et al. MEGAN analysis of metagenomic data[J]. Genome Research，2007，17（3）：377-386.

[12]王磊，张永东. 牛粪好氧堆肥处理技术[J]. 中国牛业科学，2014，40（5）：87-89.

[13]Doronina N，Kaparullina E，Trotsenko Y. The family methylophilaceae[M]. New York：Springer，2013.

[14]黄丹莲. 堆肥微生物群落演替及木质素降解功能微生物强化堆肥机理研究[D]. 长沙：湖南大学，2011.

[15]李俊，姜昕，李力，等. 微生物肥料的发展与土壤生物肥力的维持[J]. 中国土壤与肥料，2006（4）：1-5.

[16]王昀璐，花日茂，唐欣昀. 寡养单胞菌在环境保护中的应用研究进展[J]. 安徽农业科学，2010，38（28）：15796-15797，15800.