黄芩苷对缺血性脑损伤雄性大鼠脑保护作用的机制研究

李海燕，潘彦舒，程晓娜，王东辉，郭洋洋，刘锦林



黄芩苷对缺血性脑损伤雄性大鼠脑保护作用的机制研究

李海燕，潘彦舒，程晓娜，王东辉，郭洋洋，刘锦林

北京中医药大学中医学院，北京 100029

目的 观察黄芩苷对缺血性脑损伤雄性大鼠的脑保护作用及其对大鼠血清孕酮水平的影响，探讨其可能的作用机制。方法 采用成年SD雄性大鼠制造永久性左侧大脑中动脉梗阻模型，根据神经功能评分，分为模型组、黄芩苷组和抑制剂组，假手术组不插入拴线。造模后于不同时间点进行神经功能评分及双前肢抓力测定，计算抓力下降率；ELISA检测血清孕酮和促肾上腺皮质激素（ACTH）含量。结果 与假手术组比较，模型组大鼠神经功能受损，双前肢抓力显著减小。治疗7 d后，与模型组比较，黄芩苷组神经功能评分降低，双前肢抓力恢复，抓力下降率减小（＜0.05）；与黄芩苷组比较，抑制剂组黄芩苷神经功能保护作用降低（＜0.05）。治疗7 d后，与模型组比较，黄芩苷组血清孕酮水平显著升高（＜0.01），ACTH水平有升高趋势；与黄芩苷组比较，抑制剂组血清孕酮和ACTH水平均降低（＜0.05）。结论 黄芩苷对缺血性脑损伤雄性大鼠的脑保护作用可能与其调控孕酮生成有关。

黄芩苷；孕酮；促肾上腺皮质激素；缺血性脑损伤；神经功能；雄性大鼠

有研究显示，黄芩苷是中药黄芩的主要有效成分之一，能够发挥减少脑梗死体积、减轻脑水肿和抑制细胞凋亡等脑保护作用[1-2]，同时，也能提高怀孕小鼠的孕酮水平，起到保胎作用[3]。孕酮被证实有良好的脑保护作用[4-6]。本团队在前期研究工作中发现，黄芩苷可以通过提高血清孕酮水平发挥对缺血性脑损伤雌性大鼠的脑保护作用[7]。本实验观察黄芩苷对缺血性脑损伤雄性大鼠的脑保护作用和对血清孕酮水平的影响，同时设立抑制剂组，观察大鼠在血清孕酮生成受到抑制后，黄芩苷的脑保护作用是否也受到抑制，从而明确黄芩苷对缺血性脑损伤雄性大鼠的脑保护作用是否与其调控孕酮生成有关。

1 实验材料

1.1 动物

雄性SD大鼠50只，10周龄，SPF级，体质量（240±20）g，北京维通利华实验动物有限公司，动物许可证号SCXK（京）2012-0001，常规饲养于北京中医药大学病理学三级科研实验室动物房。

1.2 药物及制备

黄芩苷，成都曼斯特生物科技有限公司，批号MUST-15062716，纯度98.59%；甲磺酸溴隐亭片，匈牙利吉瑞大药厂，批次2015/06，规格2.5 mg/片。黄芩苷溶液配制：将黄芩苷粉末用PBS配制成7.5 mg/mL黄芩苷溶液，再用NaOH溶液将pH值调至7.0，用生理盐水稀释至2.5 mg/mL；溴隐亭混悬液配制：将溴隐亭片碾成粉末状，置于蒸馏水中充分混匀，配成0.1 mg/mL溴隐亭混悬液。

1.3 主要试剂与仪器

大鼠孕酮ELISA试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司；大鼠促肾上腺皮质激素（ACTH）ELISA试剂盒，中生北控生物科技股份有限公司；PBS，Solarbio。电子分析天平（AE160型，瑞士Mettler公司），高频小电刀（1411型，上海医疗器械技术公司），低速冷冻医用离心机（R320型，北京白洋医疗器械有限公司），抓力测定仪（47200型，UgoBasile公司）。

2 实验方法

2.1 造模

造模方法参照Longa法[8]，大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液（0.35 mg/kg体质量）麻醉，碘伏消毒颈部皮肤，在颈部正中切开一个长约2～3 cm的切口，结扎左侧颈外动脉（ECA）远心端，电凝刀电断ECA，从ECA残端剪一个V型口插入栓线，到达大脑中动脉起始端，抑制大脑中动脉血液供应，结扎ECA残端，剪断多余栓线（假手术组仅结扎ECA），术区使用少许青霉素粉进行消毒，缝合手术切口。神经功能评分≥3分者为造模成功。

2.2 分组及给药

根据神经功能评分将模型大鼠均匀分为模型组、黄芩苷组和抑制剂组（即在给予模型大鼠黄芩苷治疗的同时应用溴隐亭抑制孕酮生成）。给药剂量由预实验结果确定。模型组和假手术组予6 mL/kg生理盐水腹腔注射和5 mL/kg蒸馏水灌胃，黄芩苷组予6 mL/kg黄芩苷溶液腹腔注射和5 mL/kg蒸馏水灌胃，抑制剂组予6 mL/kg黄芩苷溶液腹腔注射和5 mL/kg溴隐亭混悬液灌胃。4组大鼠均于术后24 h开始给药，每日1次，7 d后取材。

2.3 检测指标

2.3.1 神经功能评分 参照Bederson法[9]，总分为10分。分别于术后2～4 h和1、3、7 d进行神经功能评分。方法：①提起鼠尾，观察右前肢表现。1分：内收，但不贴身；2分：内收，贴于身体；3分：内收贴于身体并踡缩；4分：大鼠躯体向右侧旋转。②将动物置一金属网上，向后轻提鼠尾，观察两侧前肢肌力。0分：两侧前肢紧拉金属网肌力无显著差异；1分：右前肢拉金属网但肌力显著弱于左侧；2分：右前肢不能拉金属网。③将动物置光滑平面上，观察侧向推挡阻力。0分：双侧推挡阻力无显著差异；1分：右侧推挡阻力显著弱于左侧；2分：右推大鼠时其向右侧倾倒。④大鼠左眼上睑下垂，左眼分泌物增多者评2分。以上4项评分相加为神经功能评分。

2.3.2 抓力测定 分别于大鼠造模前一晚断食前，以及术后1、3、7 d，使用抓力测定仪进行抓力测定。实验者左手提鼠尾，右手轻轻握住大鼠的背部，将大鼠前肢轻轻放到T型拉杆上，左手沿着与拉杆垂直方向拉鼠尾，此时大鼠前肢会紧紧抓住T型拉杆，逐渐加大力量，直到大鼠的前肢从T型拉杆上脱离，仪器自动记录大鼠在这个过程中的抓力最大值。重复3次，取其均值，计算大鼠抓力下降率[（术前抓力－术后抓力）÷术前抓力×100%]。

2.3.3 血清孕酮和促肾上腺皮质激素含量检测 术后7 d，将大鼠麻醉后进行腹主动脉采血，静置1～2 h，3000 r/min离心15 min，取血清，-20 ℃冻存备用。ELISA检测血清孕酮和ACTH含量，按照试剂盒说明书进行操作。

3 统计学方法

采用SAS8.2统计软件进行分析。实验数据以±表示，组间比较采用方差分析或非参数检验。＜0.05表示差异有统计学意义。

4 结果

4.1 黄芩苷对模型大鼠神经功能评分的影响

与假手术组比较，模型组大鼠神经功能受损，神经功能评分显著升高，且各个时间点差异均有统计学意义（＜0.001）；与模型组比较，黄芩苷组大鼠神经功能术后3 d有所恢复，术后7 d明显恢复（＜0.05）；与黄芩苷组比较，抑制剂组黄芩苷神经功能保护作用降低，术后7 d差异有统计学意义（＜0.01）。结果见表1。

表1 各组大鼠术后不同时间点神经功能评分比较（±s，分）

注：与假手术组比较，***＜0.001；与模型组比较，△＜0.05； 与黄芩苷组比较，##＜0.01

4.2 黄芩苷对模型大鼠双前肢抓力的影响

与假手术组比较，模型组大鼠双前肢抓力显著减小，抓力下降率在各个时间点显著增大（＜0.001）；与模型组比较，黄芩苷组抓力在术后3 d有所恢复，术后7 d明显恢复（＜0.05）；与黄芩苷组比较，抑制剂组抓力恢复受到抑制，术后7 d差异有统计学意义（＜0.01）。结果见表2。

表2 各组大鼠术后不同时间点抓力下降率比较（±s，%）

注：与假手术组比较，***＜0.001；与模型组比较，△＜0.05； 与黄芩苷组比较，##＜0.01

4.3 黄芩苷对模型大鼠血清孕酮水平的影响

与假手术组比较，模型组大鼠血清孕酮水平有一定程度降低；与模型组比较，黄芩苷组大鼠血清孕酮水平显著升高（＜0.01）；与黄芩苷组比较，抑制剂组血清孕酮水平显著降低（＜0.05）。结果见表3。

表3 各组大鼠血清孕酮水平比较（±s，pg/mL）

注：与模型组比较，△△＜0.01；与黄芩苷组比较，#＜0.05

4.4 黄芩苷对模型大鼠血清促肾上腺皮质激素水平的影响

与假手术组比较，模型组大鼠血清ACTH水平有所升高；与模型组比较，黄芩苷组大鼠血清ACTH水平有一定程度升高；与黄芩苷组比较，抑制剂组大鼠血清ACTH水平显著降低（＜0.05）。结果见表4。

表4 各组大鼠血清ACTH水平比较（±s，pg/mL）

注：与黄芩苷组比较，#＜0.05

5 讨论

缺血性脑损伤是脑血管疾病中常见的一类疾病，2012年，卫生部调査结果显示，我国40岁以上脑卒中人口超过1000万，并且呈现年轻化的趋势，其中缺血性脑卒中占80%。而现有的治疗方法和措施，并未明显改变缺血性脑卒中致死率、致残率和复发率极高的现状。

孕酮是一种类固醇激素，主要在肾上腺、卵巢和胎盘合成；同时它也是一种神经甾体，在中枢神经系统和周围神经系统均能合成。无论男性还是女性，其体内孕酮大部分都是由肾上腺在ACTH的作用下产生和释放的，而男性循环血中的孕酮起源于肾上腺[10-12]。研究发现，孕酮能够发挥减少脑梗死的体积、减轻脑水肿、改善神经功能及促进血管再生等脑保护作用[4-6]。但孕酮在以往的临床应用中发现有很多不良反应[13-15]。

黄芩具有悠久的药用历史，始载于《神农本草经》，具有清热燥湿、泻火解毒、止血、安胎的功效[16]。黄芩苷是黄芩中含量最多的黄酮类物质[17]，现代药理研究表明，黄芩苷具有解热镇痛、抗炎、抗氧化、抗病毒和抗肿瘤等作用[18-21]。

溴隐亭是多巴胺激动剂，能够抑制ACTH的产生，从而导致孕酮在肾上腺中的产生和释放减少。本实验结果显示，治疗7 d后，黄芩苷发挥显著的脑保护作用，同时大鼠血清孕酮水平升高；应用溴隐亭抑制孕酮生成后，黄芩苷的脑保护作用降低，大鼠血清孕酮水平降低。说明黄芩苷发挥对缺血性脑损伤雄性大鼠的脑保护作用可能与其促进孕酮的生成有关。而模型组与假手术组比较，血清孕酮水平出现降低趋势，可能是由于孕酮在参加脑保护的过程中被消耗，血清ACTH水平出现升高趋势，两者变化趋势并不完全一致，可能与机体的负反馈调节有关。

综上，本实验通过观察黄芩苷对缺血性脑损伤雄性大鼠的脑保护作用及其对血清孕酮水平的影响，明确了黄芩苷发挥脑保护作用与其调控孕酮的生成有关。孕酮脑保护作用的研究已经相当成熟，且其在急性创伤性脑损伤方面的研究已通过了Ⅰ、Ⅱ期临床试验，但孕酮的不良反应成为其最终应用于临床的阻碍。黄芩苷作为天然药物黄芩的主要成分，不良反应较少，有望作为孕酮的替代药物在临床上应用。

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Study on Mechanism of Protective Effects of Baicalin on Male Rats with Ischemic Brain Injury

LI Hai-yan, PAN Yan-shu, CHENG Xiao-na, WANG Dong-hui, GUO Yang-yang, LIU Jin-lin

Objective To investigate the productive effects of baicalin on the male rats with ischemic brain injury and its effects on serum progesterone level in rats; To explore the possible mechanism of baicalin in brain protection. Methods Adult SD male rats were used to create a permanent left middle cerebral artery occlusion model. The rats were evenly divided into model group, baicalin group, inhibitor group, and sham-operation group (without inserted into the intraluminal thread) according to the neurological function scores. At different time points after modeling, the neurological function scores and the grip strength of double foreleg were measured, and the reduction rate of grip strength was calculated. Serum progesterone and adrenocorticotrophic hormone (ACTH) were detected by ELISA. Results Compared with the sham-operation group, the neurological function of rats in the model group was impaired, the grip strength of double foreleg was significantly reduced. 7 days after treatment, compared with the model group, the neurological function score of baicalin group was lowered, grip strength of double foreleg was recovered, reduction rate of grip strength was reduced (<0.05); compared with the baicalin group, protective effects of baicalin on neurological function was lowered in inhibitor group (<0.05). 7 days after treatment, compared with the model group, the serum progesterone level in baicalin group was significantly higher (<0.01), and ACTH level showed an increasing trend; compared with the baicalin group, serum progesterone and ACTH levels in the inhibitor group decreased (<0.05). Conclusion The protective effects of baicalin on the male rats with ischemic brain injury may be related to the regulation of progesterone.

baicalin; progesterone; adrenocorticotrophic hormone; ischemic brain injury; neurological function; male rats

10.3969/j.issn.1005-5304.2017.06.009

R285.5

A

1005-5304(2017)06-0035-04

国家重点基础研究发展计划（2012CB518602）;北京中医药大学在读研究生项目（2015-JYB-XS038）

潘彦舒，E-mail:13911209998@163.com

（2016-12-12）

（修回日期：2017-01-22；编辑：华强）