光照和温度胁迫下通过PSⅡ的氧自由基产生的分子机理研究进展

祝香芝

摘要分别从PS Ⅱ 电子供体端和受体端能量和电子的转移过程综述了高光和高温下通过PS Ⅱ 的氧自由基产生的分子机理研究进展，为了解植物如何在变化的环境条件下生存提供了新视野。

关键词光抑制；热失活；氧自由基

中图分类号S-3文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）30-0010-05

AbstractWe introduced research progress in the molecular mechanism of ROS produced by PS Ⅱ under high light and high temperature from energy and electron transfer on the PS Ⅱ electron acceptor and donor sides，respectively.The results provide new insights into how plants survive under adverse environmental conditions.

Key wordsPhotoinhibition；Heat inactivation；Reactive oxygen species

PS Ⅱ 是嵌入类囊体膜中的水-质体醌氧化还原酶类，催化光驱动的H2O氧化成O2，质体醌（PQ）还原成PQH2。光驱动的过程包含能量转移和电子转移，同时伴随着氧自由基（reactive oxygen species，简称ROS）的产生。在能量转移上，单线态氧是能量从三线态叶绿素转移到O2形成的。在电子转移上，ROS是对O2连环的单电子还原和分别在PS Ⅱ 电子受体端和供体端协调H2O的双电子氧化形成的。O2的单电子还原形成超氧阴离子（O2·-），它发生歧化作用生成过氧化氢（H2O2），然后在芬顿反应中被还原成羟自由基（HO·）。H2O的双电子氧化形成H2O2，它分别被氧化成O2·-、被还原成HO·。酶类和非酶类的清除系统都参与到清除ROS和维持在各种非生物（环境条件的改变，如高光强、高温和低温等）和生物（食草动物和致病菌，如病毒、细菌和真菌等）胁迫下的ROS水平。

研究表明，在高光强[1]和高温[2]条件下，PS Ⅱ 中的蛋白会受到ROS造成的氧化损伤。PS Ⅱ 中的蛋白受到的氧化修饰主要是由1O2这类ROS造成的。H2O2不太会氧化PS Ⅱ 蛋白，而OH·会氧化其产生部位的蛋白。通过体外试验分析发现，由ROS造成的PS Ⅱ 蛋白的氧化修饰发生在细胞内，被ROS抑制的蛋白的重新合成是在高光强[3]和高温[4]条件下进行的。PS Ⅱ 蛋白质氧化的研究较多，而PS Ⅱ 附近的脂质过氧化的研究较少。研究表明，在PS Ⅱ 附近形成的1O2会启动类囊体膜的脂质过氧化[5]。

笔者主要综述了近年来在高光强和高温胁迫下ROS形成的分子机理的研究进展，旨在为研究植物如何在变化的环境条件下生存提供新的视野。

1高光胁迫下活性氧的产生

在高光下，能量转移和电子转移的过程中会产生ROS。叶绿素吸收的光能通过PS Ⅱ 捕光天线复合体转移到PS Ⅱ 反应中心[6]。

1.1高光胁迫下1O2的形成

能量从三线态叶绿素或者三线态羰基转移到O2形成1O2。能量从叶绿素转移到O2发生在PS Ⅱ 捕光天線复合体和反应中心两处。在PS Ⅱ 捕光天线复合体处，三线态叶绿素是通过光敏反应形成的；而在PS Ⅱ 反应中心处，三线态叶绿素是通过三线态自由基3[P680·+PheoD1·-]电荷重组形成的。三线态羰基能量转移到O2形成1O2，是在光下由ROS起始脂质过氧化的过程中发生的。能量从三线态叶绿素转移到O2形成1O2，是高光下1O2的主要来源；而能量从三线态羰基转移到O2形成1O2，目前试验证据较少，对1O2的总量贡献极少。

PS Ⅱ 捕光复合体中的叶绿素吸收的多余能量不能被PS Ⅱ 反应中心完全利用时，能量转移就会受限。在这种情况下，单线态叶绿素可能会转变为有害的三线态叶绿素。当单线态叶绿素能量淬取不充分时，单线态叶绿素会转变为三线态叶绿素，三线态叶绿素作为光敏剂，将能量转移给O2形成1O2[7]。为了阻止1O2的形成，叶绿素和类胡萝卜素相结合，而类胡萝卜素可以淬灭三线态叶绿素的能量。类胡萝卜素包括胡萝卜素（β-胡萝卜素）和它们的含氧衍生物叶黄素类（叶黄素、玉米黄质）[8]。在PS Ⅱ 捕光天线复合体中，叶黄素和玉米黄质在三线态叶绿素的淬灭中起了很重要的作用[9-10]。叶黄素是永久地与Lhcb蛋白相协调，而玉米黄质在高光强下通过紫黄素可逆的脱-环氧化作用而积累。玉米黄质可能游离在类囊体膜中，也可能与Lhcb蛋白相结合[11-12]。4个叶黄素类的结合位点存在于PS Ⅱ 中单体（Lhcb4到Lhcb 6）的和三聚物（LHC Ⅱ）的天线蛋白处。叶黄素类结合在L1（叶黄素）和L2（叶黄素结合在Lhcb，叶黄素或者玉米黄质结合在单体的Lhcb4到Lhcb6蛋白）位点能高效地捕获三线态叶绿素的能量。叶黄素在L1（Lut620）和L2（Lut621）位点分别是与叶绿素Chl610到Chl614 和Chl602到Chl604相结合的。结合于L2的叶黄素对三线态叶绿素602和603能量的淬灭效率很高，而结合于L1的叶黄素对三线态叶绿素612能量的淬灭不起作用[13]。为了维持有效的三线态叶绿素能量的淬灭，类胡萝卜素跟叶绿素之间必须有适当的距离和方向。当类胡萝卜素和叶绿素之间的距离和方向改变时，类胡萝卜素对三线态叶绿素能量的淬灭就会减弱[14]。在这些条件下，当O2在三线态叶绿素附近时，激发能就会从三线态叶绿素转移到O2而形成1O2。比较PS Ⅱ 中单体和三聚体的天线蛋白，显示单体的天线蛋白（Lhcb6>Lhcb5>Lhcb4）相比三聚体的天线蛋白（LHCII）会产生更多的1O2[13]。

当由慢速电子转移到QA和QB电子造成电子转移在PS Ⅱ 电子受体端受限时，几种类型的电荷重组[P680·+ QA·-]和

1[P680·+PheoD1·-]激进电子对就会出现。当[P680·+ QA·-] 电子对单独地结合到P680的基态，电子反转的从QA·- 转移到 PheoD1就会形成初级的激进电子对1[P680·+PheoD1·-]，自旋方向改变后要么重组到基态的P680，要么转变为三线态自由基3[P680·+PheoD1·-]。三线态自由基3[P680·+PheoD1·-]的重组会形成三线态叶绿素3P680*，使其不受弱耦合的叶绿素二聚体PD1和PD2的束缚[15-16]。试验数据表明，在低温下三线态叶绿素位于ChlD1处[17]。3ChlD1要么直接由三线态自由基3[P680·+PheoD1·-]的电荷重组而形成，要么由三线态能量从3P680*转移到ChlD1而形成。由于2种β-胡萝卜素（CarD1和 CarD2）都远离叶绿素二聚体PD1和PD2，β-胡萝卜素没法淬灭三线态叶绿素3P680*的能量。

1.2高光胁迫下O2·-的形成

O2·-的形成是在PS Ⅱ电子受体端发生的，由O2减少1个电子而形成。脱镁叶绿素（PheoD1·-）紧密地结合质体半醌QA，与质体半醌QB或QC松散结合，质体醌和形成细胞色素b559的亚铁作为O2的电子供体[18]。由于PheoD1·-有非常强的消极的氧化还原的潜力，O2极易被PheoD1·-还原；然而，其极短的半衰期使得扩散对O2还原的限制变得不太合理。然而，由于O2和O2·-的浓度不同，O2/O2·-电子对的标准氧化还原电位由根据能斯脱方程向更正值的转变，而O2被质体醌受体变得可行[19]。对暴露在高光下的缺少QA的D1/D2/cyt b559复合体体外分离产生的一个有意义的细胞色素（Ⅲ）还原率的观察显示PheoD1·-有能力去还原O2。用伏安法对分离的类囊体膜中O2·-的检测显示O2·-的产生是通过紧密结合质体半醌QA 进行的[20]。而目前的试验证据又显示O2的还原是通过松散结合质体半醌进行的。有作者证实质体半醌是通过质体醌在QB处减少1个电子而形成的，质体醌在QC位点由cyt b559进行一电子氧化。把涉及在电子线性运输中的辅助因子分离开，cyt b559的LP形式的亚铁血红素显示可以还原O2形成O2·-[21]。

研究表明，PS bS的缺失会导致在高光下产生更多的O2·-。PS bS的缺失可能导致QA/QA·-氧化还原电子对由中间氧化还原电位向更负的值转变，从而增强由QA·-产生的O2·-的产量[22]。与受损伤的PS Ⅱ复合体在D1蛋白修复循环期间从基粒迁移到基质片层有关联的D1蛋白磷酸化显示降低了O2·-的产生[23]。D1蛋白磷酸化导致D1蛋白构象改变，进而修饰质体半醌与QB位点的松散结合。因此，QB位点的改变会带来由松散结合的肢体半醌QB·-所产生的O2·-的减少。关于这个理论，Poudyal等在2016年又做了证实。他们研究证实在高光下，在STN8激酶被敲除的小鼠中O2·-的产生增强了[24]。O2·-的产生增强是由于缺乏由STN8激酶诱导的磷酸化导致的构象改变。

1.3高光胁迫下H2O2的形成

H2O2是由O2·-的单电子还原和H2O在PS Ⅱ 电子受体端和供体端的双电子氧化分别独立形成的。H2O2由O2·-的單电子还原形成是发生歧化作用或者被质体半醌所维持。在歧化作用中，2个O2·-同时被还原、氧化形成H2O2和O2。在自发的歧化作用中，2个分子的负电荷的排斥作用使得2个O2·-的相互作用受限制，而质子化形式的超氧化物、超氧化氢自由基（HO2·-），无论是和O2·-还是和HO2·-的相互作用都是可行的。在酶的歧化作用中，O2·-的还原和氧化是由氧化还原活性金属中心的氧化还原态的改变引起的，而氧化还原活性中心的金属离子分别服务于超氧化物氧化酶（SOO）和超氧化物还原酶（SOR）。研究表明，O2·-与非血红素铁相互作用导致亚铁的氧化和过氧三价铁的形成，过氧三价铁质子化成铁氢过氧化物种（结合过氧化氢）[25]。cyt b559的铁和亚铁血红铁分别显示了SOO和SOR的活性[26-27]。除了歧化作用，PQ库中游离的PQ·-被认为也参与H2O2的形成。游离的PQ·-还原O2·-形成H2O2 [28]。研究证实在质体醌库中形成的H2O2调控高光下PS Ⅱ 捕光天线复合体的大小。此外，H2O2可能是由光敏剂产生的1O2与PQH2相互作用形成的。在类囊体膜处由PQH2还原1O2所形成H2O2可能会导致蛋白激酶STN7的二聚化，从而激活该酶。

当H2O的四电子完全氧化成O2有限时，由H2O的双电子氧化形成H2O2这种途径是由Mn4O5Ca簇来维持的。然而，在H2O的四电子氧化成O2的过程中，所有的4个锰都有氧化还原活性，H2O不完全氧化成H2O2涉及2个有氧化还原活性的锰。H2O的双电子氧化被提出涉及到S2向S0态的转换或者S1向S-1态的转换。有研究表明，结合于Mn4O5Ca簇氯化物的释放能增强H2O2的形成[29]。对桥氧基的配位羟离子的亲核攻击被提出来作为氢过氧化物形成的一个有吸引力的模型。对羟离子的亲核攻击协调Mn（4）和Cl（2），桥氧基协调Ca形态的氢过氧化中间物。配位羟离子是由H2O基质去质子化、协调Mn（4）和Cl（2）形成的，桥氧基是由H2O基质的双去质子化协调Ca形成的。锰协调的配位羟离子亲核攻击Ca协调的亲电子的桥氧基，形成过氧化氢中间物替代Cl（2）来与Mn（4）协调。Cl（2）控制H2O基质对Mn（4）的接近以及配位羟离子的亲核性，进一步控制配位羟离子和桥氧基的相互作用。H2O基质，作为配位羟离子的前体物质，当Cl（2）结合位点因释放水而对溶剂水开放时，进入催化中心。

1.4高光胁迫下HO·的形成

羟自由基（HO·）是由H2O2在PS Ⅱ 的电子受体端和供体端的单电子还原形成的。游离H2O2单电子还原形成，在PS Ⅱ 电子受体端绑定过氧化物，这2个过程显示分别由游离铁离子和非血红素铁来维持[25]。研究证实由O2·-与亚铁非血红素铁相互作用形成的过氧化物的还原可通过含氧亚铁离子中间物形成HO·。

在PS Ⅱ 的电子供体端的单电子还原形成羟自由基可能是被Mn维持的。从热力学的观点来看，通过Mn的H2O2的还原是不可行的。有人提出通过Mn的H2O2的还原可通过以下2点变得在热力学上更为有利：①Mn氧化还原电位的减少导致的Mn与蛋白的协调；②H2O2/HO·氧化还原电对标准氧化还原电位的增加导致腔体中pH的降低[30]。现已证实由Cl导致的PS Ⅱ 膜耗尽相比正常的PS Ⅱ 膜显示更高的HO·形成[29]。PS Ⅱ 电子供体端不完全的水氧化产生H2O2，H2O2还原形成HO·。

2高温胁迫下活性氧的产生

当PS Ⅱ 暴露在高温胁迫下时，PS Ⅱ 活性的减少表示为热失活的发生[31]。热失活发生在PS Ⅱ 电子受体端和供体端。在PS Ⅱ 电子供体端，热失活与水氧化抑制相联系，伴随着结合位点处的PSbO、PSbP和PSbQ蛋白以及Ca、Cl、Mn的释放[32]。在PS Ⅱ 电子受体端，热失活与电子从QA到QB转移的抑制相关联[33]。研究证实在QA/QA

·-氧化还原电对氧化还原中间电位的增加会抑制从QA到QB的电子转移。相对于高光胁迫，在高温胁迫下ROS的形成并不是由叶绿素吸收的能量驱动的；而是与热诱导的类囊体膜处结构和功能的改变有关。在PS Ⅱ 电子受体端，由脂质过氧化形成的高能量的中间物分解就形成了1O2。在PS Ⅱ 电子供体端，不完全的H2O氧化形成H2O2，在芬顿反应中H2O2被Mn还原形成HO·。

2.1高温胁迫下1O2的形成

1O2是由三线态能量转移从3L*到 O2，O2是在脂质过氧化的过程中由高能量的中间物二氧杂环丁烷或者四氧化物分解而产生的[34]。观察发现由甘露醇形成的HO·的消除不会抑制1O2的形成，显示脂质过氧化不太可能由HO·起始[35]。有研究证实，在衣藻细胞中由邻苯二酚和咖啡酸对脂肪氧合酶的抑制阻止了1O2的形成[36]。单线态氧被认为是在脂质阶段、QB位点的附近形成的[2]。由基质复合物的减少导致的PQ还原形成的PQH2可能产生ROS，进而损伤D1蛋白[37]。

2.2高温胁迫下H2O2的形成

H2O2是在PS Ⅱ 电子供体端H2O的双电子氧化形成的。现提出外源性蛋白（PSbO、PSbP和PSbQ）的释放最终导致H2O2的形成[38]。应用amplex红色荧光分析证实PS Ⅱ 膜暴露在高温（40 ℃）会导致H2O2的形成[39]。研究证实氯化物竞争性试剂——醋酸盐与Mn4O5Ca簇结合以及水通道的阻塞，会阻碍H2O2的形成。基于这些观察，在与Mn4O5Ca簇结合位点附近的氯化物的释放会导致水不可控的与Mn4O5Ca簇的易接近。维持对H2O的四电子氧化生成O2的控制，H2O与Mn4O5Ca簇的接近才能被控制。氯化物协调Mn4O5Ca簇附近的氨基酸控制H2O与金属中心的接近，然后维持适当的H2O的四电子氧化生成O2。然而，当氯化物从它的结合位点释放，H2O转移到Mn4O5Ca簇是自由的，O2不完全氧化生成H2O2就会发生。蓝细菌（Thermosynechococcus vulcanus）的PS Ⅱ 晶体结构显示2个氯化物分别在距离Mn4O5Ca簇6.67 和7.40 的位置[40]。为了避免氧化周围的氨基酸，扩散到内腔的H2O2被限制在通道中。H2O2作为类似于H2O的一个较大的极性分子，H2O2扩散到内腔很有可能是通过水通道。当H2O2通过水通道渗出，它可能与Mn相互作用而形成HO·。

2.3高温胁迫下HO·的形成

羟自由基是在PS Ⅱ 电子供体端由H2O2的单电子还原形成的。应用EPR自旋捕获光谱学证实PS Ⅱ 膜暴露在高温下会导致HO·的形成[35]。研究证实HO·的产生能完全被外源的过氧化氢酶和金属螯合剂抑制，显示HO·的形成是通过金属催化的芬顿反应进行的。此外，对外源钙和氯化物的添加阻止了HO·形成，HO·是通过Mn4O5Ca簇产生的。亦有研究证实，没有Mn4O5Ca簇的PS Ⅱ 膜不会有HO·产生[2]。在Mn4O5Ca簇的结合位点附近用醋酸盐代替氯化物以及水通道的堵塞以与H2O2一样的形式阻碍了HO·的形成，根据这些提出了氯化物在HO·的形成过程中有重要作用的假设[39]。研究者提出由不完全的H2O氧化形成的H2O2，通过芬顿反应、在从Mn4O5Ca簇释放的游离Mn调解下被还原成HO·。在高温下，Mn从它的结合位点的释放是利用原子吸收作用[41]和EPR光谱学[42-43]。用X射线吸收光谱的研究表明，Mn4O5Ca簇的分解发生在2个步骤[43]：第1步，2个Mn从它们的结合位点释放进入内腔，留下2个Mn通过1个双-μ-含氧的桥连接；第2步留下的2个Mn从PS Ⅱ 释放。

3ROS在氧化损伤中的作用

在高温下，蛋白质和脂类可能被在PS Ⅱ 形成的ROS所氧化。PS Ⅱ 蛋白被证实按以下顺序被氧化修饰：D1 > D2 > Cyt b559 > CP43 >CP47>Mn4O5Ca簇[44]。内腔中氨基酸的氧化暴露了D1蛋白的AB环，形成了24 kD的C末端和9 kD N末端碎片，然而，基质中氨基酸氧化暴露D1蛋白的D-de环形成23 kD N末端和9 kD C末端碎片[45]。用质谱分析法对D1蛋白中氨基酸的自然氧化的鉴定显示是在ROS产生位点附近发生的[46-47]。D1蛋白的氧化是在体外研究的，关于体内D蛋白的氧化证据有限[48]。D1蛋白的一个有效的修复循环包括损伤D1蛋白的水解和新合成的D1蛋白替换原来损伤的D1蛋白，这对于维持PS Ⅱ 的可行性是必需的[49-50]。参与高光下PS Ⅱ 蛋白损伤的ROS会抑制蛋白的重新合成，以翻译的延伸因子为其攻击的初始靶位点[3]。然而，考虑到有限的ROS的扩散，更可能的是在基质中产生的ROS可能在D修复循环中氧化翻译的延伸因子。由于类胡萝卜素缺乏有效的三重态能量激发的捕获，因而在PS Ⅱ 蛋白损伤过程中从结合位点释放到基质的叶绿素或者是叶绿素合成过程中的叶绿素前体是1O2合成的可能“候选者”。为了避免1O2的形成，没有束缚的叶绿素可能暂时协调光诱导的蛋白。已有研究证实小的CAB相似蛋白在PS Ⅱ 损伤的过程中可以阻止1O2的形成，很可能是通过与从受损伤的PS Ⅱ复合体释放的叶绿素相结合而进行的[51]。与膜蛋白结合的脂类会被ROS氧化。1O2起始的脂質过氧化包含1O2嵌入到多不饱和脂肪酸的双键中，然而HO·起始的脂质过氧化是通过从多不饱和脂肪酸的抽氢反应进行的。初级（LOOH）和二级（LOH、RCS和激发态分子）的脂质过氧化产物都是在高光下形成的。在植物拟南芥中羟脂肪酸的形成证实了这点[5]。1O2对多不饱和脂肪酸的氧化导致LOOH的形成，进一步形成LOH的同分异构体（10-HOTE和15-HOTE）。

在高溫下，ROS氧化蛋白质和脂类。已有研究表明，类囊体膜暴露在高温下会导致D1蛋白的剪切，形成9 kD C末端和23 kD N末端碎片，FtsH蛋白酶涉及到高温下D1蛋白的剪切中[52]。有研究表明，通过在QB位点与在脂质过氧化中形成的LOO·结合形成的1O2， 通过与D1蛋白的D-de环以一种与在高光下相似的方式相互作用导致D1蛋白的降解[2]。虽然内源ROS对PS Ⅱ 蛋白的氧化损伤的试验证据已在体外获得，但是高温下体内PS Ⅱ 蛋白损伤情况尚不明确。除了涉及到PS Ⅱ 蛋白氧化损伤中的ROS，也提出ROS抑制高温下蛋白的重新合成。脂质过氧化与RCS相关[4]。在高温胁迫下，植物拟南芥中会有丙二醛形成。

4结语

植物在自然界中经常会遭受各种胁迫，从而影响它们的生存和生长。由于光合作用的光反应被抑制会在其他细胞功能被损伤前发生，因此研究高光对光合作用的影响具有重要意义。在自然界中，植物会同时受到多种胁迫，高光强胁迫又与造成全球变暖的高温胁迫相关。已有研究主要集中在高光、高温或者这2个胁迫下光合复合体结构和功能的改变。研究通过PS Ⅱ 的ROS形成的分子机制有助于了解植物在高温和高光胁迫下对环境的适应过程。

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