中华按蚊拟除虫菊酯杀虫剂击倒抗性突变的研究进展

周巧玲　陈梦丽

摘要主要阐述了钠离子通道的结构和功能、拟除虫菊酯杀虫剂的作用机理，总结了中华按蚊钠离子通道中与拟除虫菊酯杀虫剂抗性相关的kdr突变及其抗性机理，为后续中华按蚊抗性机制的深入研究提供了理论依据。

关键词钠离子通道；拟除虫菊酯杀虫剂；击倒抗性；kdr突变；中华按蚊

中图分类号S482.3+5文献标识码

A文章编号0517-6611（2017）30-0143-03

Abstract

We introduced the structure and function of sodium channel，the mode of action of pyrethroids，identification and functional characterization of pyrethroid resistanceassociated sodium channel mutations from Anopheles sinensis，which would provide the molecular basis for further study of resistance mechanism of Anopheles sinensis to pyrethroid insecticides.

Key wordsSodium channel；Pyrethroid insecticides；Knowdown resistance；kdr mutations；Anopheles sinensis

拟除虫菊酯杀虫剂（Pyrethroid insecticides）是从天然除虫菊素衍生而来的一类人工合成的化学农药，主要以神经钠离子通道为作用靶标，其因杀虫活性高、击倒速度快、杀虫谱广、对哺乳动物低毒、 环境中易降解等特性而被广泛应用于农业生产和家庭卫生害虫的防治。拟除虫菊酯杀虫剂可以作为蚊子的毒杀剂和驱避剂，能有效防治传染病媒介——蚊子，所以世界卫生组织推荐使用该类杀虫剂防治蚊子[1]。但是随着拟除虫菊酯农药的大量使用，抗药性问题日益突出。蚊子作为疟疾、登革热等疾病的主要传播媒介，如果其群体数量得不到有效的控制，将会给人类带来极大的威胁，利用生物化学防治手段以切断传播途径是防治疾病的重要措施。

蚊子对拟除虫菊酯杀虫剂的抗性主要分为代谢抗性和靶标抗性。代谢抗性是由于蚊子代谢解毒酶活性增强引起的。主要由于代谢解毒酶如P450酶的代谢变强，P450酶具有解毒作用，通常可将脂溶性有毒物质代谢为水溶性物质，使有毒物质排出体外。而靶标抗性则是由于杀虫剂作用靶标敏感性降低造成的。主要是由于电压门控钠离子通道氨基酸位点发生非同义突变，导致拟除虫菊酯杀虫剂和靶标钠通道的亲和力下降[2-3]。

中华按蚊普遍分布于中国和东南亚，是中国常见的蚊子之一，是疟疾的主要传染媒介。笔者主要介绍了钠离子通道的结构和功能、拟除虫菊酯杀虫剂的作用机理、击倒抗性、中华按蚊中与拟除虫菊酯杀虫剂抗性相关的kdr突变及其作用机制，旨在为进一步研究中华按蚊对拟除虫菊酯的抗性机理提供参考。

1钠离子通道

1.1离子通道

离子通道是指由贯穿质膜的由多亚基组成的蛋白质，通过构象变化而形成的调控离子跨膜运转的门系统，通过门的开闭控制离子运转的种类和速度。依据其活化的方式不同，离子通道可分2类：一类是电压活化的通道，称做电压门控离子通道，即通道的开放受膜电位的控制，如钠离子通道、钙离子通道、氯离子通道；另一类是配体活化的通道，称做配体门控离子通道，即靠配体与膜上受体相互作用而活化的通道，如乙酰胆碱受体通道、氨基酸受体通道。钠离子通道是所有动物中电信号的主要启动键，而电信号则是神经活动和肌肉收缩等一系列生理过程的控制基础，是有机氯杀虫剂以及拟除虫菊酯类杀虫剂等重要化学农药的作用靶标[4]。

1.2昆虫钠离子通道的结构与功能

昆虫钠离子通道和哺乳动物钠离子通道类似，由1个α亚基和几起辅助作用的亚基（TipE、TEH1-4）组成，较大的α亚基形成离子渗透孔洞，而较小的辅助亚基则起到调节通道功能和增加表达量的作用[5]。α亚基蛋白由1 800～2 500个氨基酸残基组成，包含4个同源结构域（Ⅰ～Ⅳ），每个结构域又由6个疏水性跨膜螺旋体（S1～S6）组成，其中S1～S4组成电压感受模块，S5、S6以及连接于S5和S6之间的保守序列元件（P-LOOP）构成了供钠离子通过的孔道模块，电压感受模块与孔道模块之间通过短肽（L45）连接。S5、S6跨膜片段参与Na+亲水孔道的形成，4个结构域共8个跨膜片段形成细胞亲水孔道结构。4个P-LOOP上分别有D、E、K、A 4个氨基酸残基，决定通道的选择性[6]。每1个同源结构的S4区域还包含了1个保守元件，其特征是带正电荷的精氨酸或赖氨酸的重复序列，这些氨基酸之间分别由2个中性氨基酸隔开，形成电压传感器。结构域 Ⅲ 和 Ⅳ 之间有1个较短的保守序列片段，构成通道的失活门，哺乳动物中为IFM（异亮氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸），昆虫中为MFM（甲硫氨酸-苯丙氨酸-甲硫氨酸）[7]。每一个结构域都可以因为电子移动从而产生电流电压，细胞去极化时，S4上的正电荷能检测膜电场，使得电压传感器S4向膜外移动，随之S1、S2、S3移动，通道的构象发生改变，只有当4个结构域的构相都发生改变后，Na+跨膜通道才打开。通道开启数毫秒后，S4向后移动，随之S1、S2、S3向后移动，则通道关闭。钠离子通道的拓扑结构见图1。

2拟除虫菊酯杀虫剂作用机理

钠离子通道在动作电位的产生和传递过程中起非常重要的作用，是动作电位上升相的主要组成部分，主要通过钠离子通道的激活和失活实现。正常情况下，钠离子通道开放数毫秒后，通道失活并关闭；但是DDT和拟除虫菊酯杀虫剂能够抑制通道失活，延长通道开放时间，干扰钠离子通道正常功能，造成神经传导障碍[8]。目前已知拟除虫菊酯类农药在昆虫鈉离子通道上有2个对称的结合位点，分别是结合位点 Ⅰ （Pyrethroid binding site 1，PyR1）和结合位点 Ⅱ （Pyrethroid binding site 1，PyR2）。以钾离子通道为模型进行计算机模拟，OReilly等[9]提出拟除虫菊酯结合位点由结构域 Ⅱ 的S4-S5连接肽、结构域 Ⅱ 的跨膜螺旋S5和结构域 Ⅲ 的跨膜螺旋S6组成，即 Ⅱ L45-Ⅱ S5-Ⅲ S6组成。之后Dong实验室提出除了上述结合位点外，还存在与之对称，但并不完全一致的结合位点存在，该位点由结构域 Ⅰ 的S4-S5连接肽、结构域 Ⅰ 的跨膜螺旋S5、S6和结构域 Ⅱ 的跨膜螺旋S6组成，即Ⅰ L45-Ⅰ S5-Ⅰ S6-Ⅱ S6组成[10-11]，并且将前者称为结合位点 Ⅰ，后者称为结合位点 Ⅱ。因此，目前认为拟除虫菊酯杀虫剂在昆虫钠离子通道上的结合位点有2个，且2个结合位点同时起作用。

3击倒抗性

击倒抗性（Knock down resistance，kdr）是拟除虫菊酯杀虫剂抗性的重要机制，是指钠离子通道靶标部位敏感度降低而对DDT和拟除虫菊酯产生的抗性。击倒抗性的产生与钠离子通道氨基酸序列发生非同义突变有关，这些氨基酸突变很可能导致物种对拟除虫菊酯杀虫剂产生抗性，因此又称做kdr突变位点[12]。目前，已经在节肢动物害虫和传染病媒介的抗性品系中发现50多个和拟除虫菊酯杀虫剂抗性相关的kdr突变[6]。其中一部分kdr突变已在爪蟾卵母细胞表达体系中进行功能验证，结果表明kdr突变主要通过改变钠离子通道门控或者减少拟除虫菊酯杀虫剂在钠离子通道上的结合而使钠离子通道对拟除虫菊酯杀虫剂的敏感性降低，从而导致物种对拟除虫菊酯类农药产生抗性。

4中华按蚊钠离子通道的kdr突变

最早发现的kdr突变是位于结构域 Ⅱ S6的突变位点L1014F（以家蝇钠离子通道的氨基酸序列命名），该位点在家蝇和德国小蠊钠离子通道中都存在[13]。随后在冈比亚按蚊[14]、淡色库蚊[15]、麦长管蚜[16]、棉铃虫[17]、小菜蛾[18]、马铃薯甲虫[19]、桃蚜[20]等物种中发现该位点其他氨基酸突变： C、S、W、H，其中L1014F是最常见的，而其余4种发生的频率不高[8]。在我国进行中华按蚊的抗性位点检测，发现钠离子通道 Ⅱ S6的L1014位点上存在3种突变，分别是TTG（L）被TTT（F）替换、TTG（L）被TTG（F）替换、TTG（L）被TGT（C）替换。并且还发现早在1997年，江苏和山东就已存在TTT（F）和TGT（C）的kdr突变，其中TTT（F）是频率最高的突变，在中部地区河南、山东、江苏、安徽、江西、湖北等地都发现了该kdr突变[21]。Yang等[22]鉴定了广西壮族自治区9个地区中华按蚊的钠离子通道1014位氨基酸的多样性，结果表明除了野生型1014L外，百色市和南宁市只有1014S氨基酸突变位点；贺州市、贵港市和桂林市有1014F和1014C 2种突变位点；而玉林市、梧州市、柳州市和河池市有1014S、1014F和1014C 3种氨基酸突变位点，并且这些kdr位点的发生频率逐年上升。另外，广西壮族自治区桂平市的中华按蚊经等位基因特异性PCR、PIRA-PCR、PIM-PCR鉴定，发现突变位点L1014S、L1014F、L1014W和1个新的突变位点N1013S[23]。在其他国家也发现了这些kdr突变，例如在韩国中华按蚊中发现L1014F（TTT）、 L1014F（TTC）和L1014C（TGT）突变[24]；老挝、越南、哥伦比亚等地的中华按蚊中都发现了L1014S的突变位点[25]。

迄今为止，蚊子中与拟除虫菊酯抗性相关的kdr位点不如其他节肢动物害虫多，埃及伊蚊中共发现10个kdr突变位点，分别是G923V、L982W、S989P、V1016G/I、I1011M/V、T1520I、F1534C和D1763Y，并且这些kdr突变位点常常是共同存在，且共同存在时抗性系数更高[26]，但在中华按蚊中还未检测到类似现象。目前，从中华按蚊中只发现5个钠离子通道突变位点：L1014F、L1014S、L1014W、L1014C和N1013S，所以需要大量的样品采集，并进行钠离子通道的全长分析，才能鉴定得到更多与拟除虫菊酯抗性相关的kdr突变位点。

5kdr突变的功能研究

抗性物种中鉴定得到的kdr突变，需要体外试验验证才能确定其是否真的使物种对拟除虫菊酯杀虫剂产生抗性。爪蟾卵母细胞表达体系和双电极电压钳技术是研究拟除虫菊酯杀虫剂和钠离子通道相互作用的有效手段，很多kdr突变位点经该体系验证，表明其确实能够降低拟除虫菊酯杀虫剂对钠离子通道的结合力，从而导致拟除虫菊酯抗性的产生。L1014F位点最早发现于家蝇，之后在许多物种中均有发现该突变位点或者该位点的其他氨基酸突变，并且常被发现和其他kdr位点同时存在[8]。OReilly等[9]通过计算机建模，模拟钠离子通道和拟除虫菊酯的结合，预测L1014位点位于拟除虫菊酯类杀虫剂和钠离子通道的结合位点。Burton等[26]将L1014F/L1014S/l1014H引入果蝇钠离子通道，发现突变位点L1014F和L1014H使50%钠离子通道的激活电压往去极化方向分别移动4和3 mV，L1014S不移动50%钠离子通道激活的电压，但激活曲线的衰减却明显比野生型快。实验发现三者都降低了果蝇钠离子通道对拟除虫菊酯杀虫剂的敏感性，但是三者作用有差别，L1014F显著降低果蝇钠离子通道对氯菊酯和溴氰菊酯的敏感性；而L1014H降低果蝇钠离子通道对溴氰菊酯的敏感性，对氯菊酯的作用则不如溴氰菊酯强；L1014S则对DDT产生很明显的抗性。之后Du等[10-11]将L1014F/L1014S引入埃及伊蚊、德国小蠊钠离子通道，发现两者都降低了钠离子通道对氯菊酯和溴氰菊酯的敏感性。不同物种钠离子通道的电压钳试验都表明，L1014位点的突变都降低了钠离子通道对拟除虫菊酯杀虫剂的敏感性，因此L1014突变被认为是直接导致抗性的原因。而N1013S突变频率很低，并且样本少，所以对它的研究较少。

这些kdr突变在抗性物种中以纯合体或杂合體的形式存在，物种抗性产生程度也与突变位点的频率有关，并且不同的氨基酸突变对杀虫剂的作用也有差别，有学者发现L1014S突变频率较低，对拟除虫菊酯类杀虫剂抗性影响不大，对DDT抗性影响较大；L1014C突变主要针对于溴氰菊酯而不针对于氯氰菊酯和DDT[27]。很多kdr突变并未确证是否参与抗性产生，因此，需要对大量突变类型的样本进行研究，并用电压钳试验进行体外验证，结合计算机模拟钠离子通道突变体与拟除虫菊酯杀虫剂的相互作用，初步揭示这些kdr突变的功能。清华大学最近发现第1个真核生物电压门控钠离子通道的近原子分辨率三维结构[28]，若是以该钠离子通道结构模拟其与拟除虫菊酯杀虫剂的结合，则能更精准地预测钠离子通道和拟除虫菊酯的相互作用，为进一步探索kdr突变和拟除虫菊酯杀虫剂抗性的关系奠定基础。

6結语

在杀虫剂的选择压力下，抗性品系的蚊子将会生存下来并繁殖出更多具有更高抗性的后代，对于杀虫剂特别是拟除虫菊酯杀虫剂的抗性问题，将会更加严重。在中华按蚊中发现的与抗性相关的kdr突变并不多，因此，需要收集更多的抗性按蚊，对整个钠离子通道基因进行扩增检测，而不只是对某一片段进行检测，从而发现新的kdr突变。按蚊kdr突变位点的发现并进行功能验证将为人们研究拟除虫菊酯杀虫剂的作用位点以及拟除虫菊酯杀虫剂的抗性机理提供有力的分子水平上的依据。

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