维吾尔族、汉族宫颈病变组织中HPVl6E6、E7蛋白表达研究

韩莉莉　刘晓婉　昆多孜

摘要 目的：探讨维、汉族宫颈组织中HPVl6E6、E7蛋白表达差异以及引起宫颈病变中的作用机制。方法：收集宫颈组织123例，检测HPV-DNA、E6、E7蛋白。结果：维吾尔族、汉族E6、E7蛋白在不同等级宫颈病变中表达率差异具有统计学意义（P<0.005）。维吾尔族不同等级宫颈病变组织HPV阳性率比较差异具有统计学意义（P<0.005）。结论：维、汉族宫颈病变组织中HPVl6E6、E7蛋白阳性表达率差异有统计学意义，维吾尔族中随着宫颈病变级别增加，HPV阳性率增加，E6、E7蛋白检测可预测宫颈病变进展及预后。

关键词 宫颈病变；E6、E7蛋白；HPV

1992年WHO宣布人类乳头状瘤病毒（HPV）是引起宫颈癌变的首要因素。HPV两个早期编码框架E6/E7基因的表达产物E6/E7原癌蛋白在肿瘤发生、细胞周期调控及凋亡调节中起重要作用，是宫颈癌发生、发展的重要原因。但有关癌组织中E6/E7蛋白表达在宫颈癌发生、发展中的作用及其相互关系仍有争论。本研究通过研究HPVl6E6、E7蛋白与宫颈上皮内瘤变的发生与发展以及与宫颈癌相关性，为宫颈癌早期诊断与早期防治提供新的手段。

资料与方法

2010年9月-2013年3月新疆维吾尔自治区人民医院妇科门诊及住院患者手术或活检存档蜡块，其中鳞癌51例，年龄26～65岁；宫颈上皮内瘤变CIN I级22例，年龄24～56岁；CINⅡ～Ⅲ期40例，年龄35～65岁，宫颈炎30例，年龄21～56岁。采取全部患者标本后甲醛固定，石蜡包埋，切片，常规HE染色，确定病理学诊断、组织学类型；患者均为无宫颈手术史、未行过宫颈物理治疗及干扰素治疗、受试时未怀孕、无化疗史及骨盆放射治疗史的妇女。入选病例均经病理诊断明确。

方法：切除部分标本经过甲醛充分固定、取材并常规脱水、透明后，以石蜡包埋备用。全部标本均经10%福尔马林溶液固定，石蜡包埋，连续切片，4um厚，以备常规病理和免疫组化用；一抗HPV16E6、E7鼠抗人多克隆抗体购自北京博奥森，二抗试剂盒（兔抗鼠）、二氨基联苯胺（DAB）显色剂均购自北京中山生物公司；实验方法采用免疫组化链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法，HPVl6E6、E7-抗浓度1：100，二抗为即用型工作液，DAB显色，伊红染液复染。染色步骤严格按试剂盒说明书进行，分别用已知宫颈癌阳性切片做阳性对照，以磷酸缓冲液（PBS）代替一抗作为阴性对照。

判断标准：HPV16E6/E7蛋白以胞质、细胞核和核周缘出现棕黄色颗粒为阳性。在高倍镜下（400×）对每张切片随机选择了5个视野，共计1 000个肿瘤细胞，其中阳性细胞数<5%为阴性（-），阳性细胞数5%～10%为弱阳性（+），阳性细胞数11%～50%为中度阳性（++），阳性细胞数>50%为强阳性（+++）。统计阳性表达的例数，并进行比较分析。

统计学方法：数据分析采用SAS 9.0进行统计学分析，计数资料采用x2检验，P<0.05为差异有统计学意义。

结果

维吾尔族、汉族不同宫颈病变级别中E6、E7蛋白阳性率比较：汉族E6蛋白在宫颈炎、CIN Ⅰ、CINⅡ～Ⅲ级、宫颈癌组阳性表达率分别为0.00%（0/0）、23.08%（3/48）、55.56%（10/48）、100%（6/48）；维吾尔族E6蛋白在宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ级、宫颈癌组的阳性表达率分别为5.26%（1/75）、44.44%（4/75）、72.73%（16/75）、100%（24/75）；汉族E7蛋白在宫颈炎、CIN Ⅰ、CINⅡ～Ⅲ级、宫颈癌组阳性表达率分别为0.00%（0/0）、23.08%（3/48）、72.22%（13/48）、100%（6/48）；维吾尔族E7蛋白在宫颈炎、CINⅠ、CINⅡ～Ⅲ级、宫颈癌组阳性表达率分别为10.53%（2/75）、33.33%（3/75）、68.18%（15/75）、100%（92/75）。维吾尔族、汉族E6、E7蛋白在不同等级宫颈病变中表达率差异具有统计学意义（P<0.005）。见表1～4。

维吾尔族、汉族宫颈不同病变级别HPV阳性率比较：汉族患者中在宫颈炎、CIN Ⅰ、CINⅡ～Ⅲ级、宫颈癌组HPV阳性率分别为91.30%（10/11）、100.00%（13/13）、87.50%（14/16）、83.33%（5/6）；维吾尔族患者在宫颈炎、CIN Ⅰ、CINⅡ一Ⅲ级、宫颈癌组HPV阳性率分别为31.58%6/19）、88.89%（8/95）、81.82%（18/22）、100%（25/25）。其中维吾尔族不同等级宫颈病变组织HPV阳性率比较差异具有统计学意义（P<0.005），见表5、6。

讨论

宫颈癌危害着女性身体健康，女性发病率高的生殖道恶性肿瘤中宫颈癌排在第1位。目前国内外研究者从RNA、DNA和蛋白水平等其他方面不断研究子宫颈癌的发病机制和早期防治。HPV感染机体的宿主细胞后，在宿主细胞中HPV基因组是两种存在状态：游离状态和整合状态。在良性宫颈病变中HPVDNA大多以游离状态存在，但在恶性病变中多数是以整合状态存在。而且低危型HPV DNA游离状态多，几乎不整合到宿主细胞的基因组中去，但绝大多数高危型HPV DNA能整合到宿主细胞DNA中，会引起基因突变、缺失，许多抑癌基因和癌基因的表达被干扰，进一步加快了CIN进展为宫颈浸润癌的可能性。一般HPV感染的早期，HPV病毒癌基因表达水平低，在病毒基因组不断整合到宿主基因组的过程中，HPVE6/E7mRNA会出现持续的高水平转录，E6、E7癌蛋白被大量表达，促使宫颈病变继续发展为宫颈癌。

HPVE6癌蛋白各个型别的蛋白中都存在一个锌指结构Cys-x-x-Cys。P53和E6关联蛋白（E6-AP）的结合可以影响细胞周期。P53是细胞周期调控、凋亡控制和基因转录过程中一个关键的蛋白。HPV阳性的细胞主要靠E6关联蛋白介导降解，在出现刺激或者DNA损伤时，P53会被正常细胞激活，由于下游基因的转录被抑制，細胞停滞在s期，DNA经过修复进入细胞周期；完成有丝分裂；但高危型HPVE6的细胞可以通过降解P53，使细胞略过检验点G1/S，这些细胞积累了损伤的DNA，继续进入细胞周期，引起基因组的不稳定性。

E6和E7蛋白都有单独引起人类细胞的永生化的能力，但E6、E7同时表达时有协同作用一，它们协同后使细胞周期脱耦联以及中心体复制，纺锤体检测点功能被干扰，引起基因组完整性变化以及中心体数目变化，最终引起肿瘤的出现。研究显示E6蛋白的转化能力低于E7蛋白，疾病早期E7蛋白表达较多，疾病晚期E6蛋白表达较多，在恶性病变中E6蛋白中表达较多。

本研究发现在汉族、维吾尔族不同级别宫颈病变组织中E6、E7蛋白的阳性率差异具有统计学意义。随着宫颈病变级别的增加，HPVl6E6、E7蛋白表达也增加。在维吾尔族患者中随着宫颈病变级别的增加，HPV阳性率也增加，差异有统计学意义。但在汉族不同宫颈病变级别中HPV阳性率差异无统计学意义，可能和样本偏少有关。建议临床在开展HPVDNA检测的同时，必要时做HPVl6E6、E7蛋白检测，特别对于HPV持续感染者有较显著的意义，为宫颈癌的早期诊断和预防提供一种新的预警手段。