结核性盆腔炎患者外周血TH17/Treg细胞的表达*

刘玉娟，蔡秋娥， 张洁云,朱秀云,张明霞，陈献雄

(1.深圳市第三人民医院a.妇产科，b.研究所，广东深圳 518112；2.深圳大学医学院实验中心，广东深圳 518060)

·临床实验研究·

结核性盆腔炎患者外周血TH17/Treg细胞的表达*

刘玉娟1a，蔡秋娥1a， 张洁云1b,朱秀云1b,张明霞1b，陈献雄2

(1.深圳市第三人民医院a.妇产科，b.研究所，广东深圳 518112；2.深圳大学医学院实验中心，广东深圳 518060)

目的 了解结核性盆腔炎患者外周血TH17/Treg细胞免疫应答情况，探讨其在结核性盆腔炎发病中的作用。方法 采用胞内流式细胞术分别检测46例结核性盆腔炎患者治疗前外周血TH17和Treg细胞的表达水平，以健康育龄期妇女25例作为对照，并对28例患者抗结核治疗3个月和6个月后TH17/Treg细胞的变化情况进行随访检测。结果 结核性盆腔炎患者外周血TH17细胞的百分比为(3.26±1.30)%，明显低于对照组(4.92±1.71)%(P<0.01)，Treg细胞的百分比为(5.18±1.53)%，明显高于对照组(3.26±1.10)%(P<0.01)；结核性盆腔炎患者治疗6个月后TH17细胞表达水平(4.67±1.75)%明显高于治疗前(3.26±1.30)%及治疗3个月(3.70±1.06)%，差异均有统计学意义(P均<0.01)；治疗6个月后Treg细胞表达水平为(3.93±0.94)%，明显低于治疗前(5.18±1.53)%及治疗3个月(4.94±1.51)%，差异有统计学意义(P均<0.01)；治疗6个月后Treg细胞仍高于对照组(P<0.05)；治疗前TH17/Treg细胞的比值较对照组明显降低(P<0.01)，治疗3个月后升高不明显，治疗6个月后TH17/Treg细胞的比值(1.18±0.34)%较治疗3个月(0.77±0.21)%和治疗前(0.55±0.13)%升高明显(P均<0.01)，但仍未恢复至正常水平(P<0.01)。 结论 TH17/Treg细胞参与了结核性盆腔炎患者的免疫应答，并存在TH17/Treg的失衡状态。

结核性盆腔炎；TH17细胞； Treg细胞；流式细胞术

近年来不孕症及不良妊娠结局中盆腔结核发病率明显增高，由于临床症状不典型和缺乏高敏感性及特异性的实验室检测方法，使得临床早期确诊率极低[1]。而检测结核性盆腔炎患者外周血TH17/Treg在免疫应答中的作用可为临床早期诊治提供新的依据。结核菌感染诱导产生的免疫以CD4+T细胞为主，其在清除体内结核分枝杆菌过程中具有重要的作用。以往的抗结核免疫研究多侧重于CD4+T细胞TH1/TH2亚群[2]，近年来通过对TH17和Treg细胞在肺结核中的研究发现，TH17在结核免疫中起保护作用， Treg细胞则抑制结核免疫的发生[3-4]，但国内外有关其在结核性盆腔炎中的临床意义的报道少见。本研究通过检测结核性盆腔炎患者外周血TH17/Treg表达水平，探讨TH17/Treg在结核性盆腔炎免疫及发病中的作用，报道如下。

1 对象与方法

1.1 研究对象 收集2013年3月至2014年12月在深圳市第三人民医院住院的结核性盆腔炎患者46例，年龄(32.4±5.0)岁。纳入标准：(1)腹腔镜手术中见到粟粒样结核结节、结核球或者干烙样坏死，宫腔狭窄、瘢痕粘连甚至实变; (2)组织活检发现结核特征性病理改变; (3)结核分枝杆菌抗酸染色、PCR法或者结核杆菌培养阳性。上述任何一项结果阳性，即可确诊为结核性盆腔炎。排除标准：合并HIV感染，灭活血清反应素试验(USR)阳性，支原体、衣原体、淋球菌感染及内外科严重合并症，盆腔包块性质不明、腹腔镜检查腹膜有广泛粘连者。以同期在本院就诊的健康育龄期女性作为对照组，年龄(28.7±6.1)岁。本研究经医院医学伦理学委员会批准，患者均知情同意。

1.2 结核性盆腔炎患者治疗方案及随访 采用异烟肼、利福平、乙胺丁醇、吡嗪酰胺四联药物联合，强化治疗3个月，异烟肼、利福平、乙胺丁醇三联巩固治疗9个月。治愈标准：规范治疗1个疗程，停药动态观察1年，患者月经量正常，无明显痛经，无盆腔包块。患者病情转归：46例结核性盆腔炎患者随访至6个月时，失访5例，肝功能损害8例，肾功能损害3例，药物过敏1例，白细胞减少1例，其余28例经过规范抗结核治疗后治愈，随访至抗结核治疗3个月、6个月，观察其外周血TH17/Treg水平变化。

1.3 主要试剂和仪器 淋巴细胞分离液LymphoprepTM(10771-500ML)、佛波酯PMA(P1585-10MG)、离子霉素Ionomycin(C2230-50UG)、蛋白质转运抑制剂Brefeldin A(20350-15-6)均购自美国Sigma-Aldrich公司，小鼠抗人单克隆抗体CD3-APC(345767)、CD8-PerCP(345774)、Foxp3-PE(560046)、IL-17-Alexa Fluor®700(560613)，FACS Lysing Solution溶血素(349202)、FACS Permeabilizing Solution破膜剂(554722)、Foxp3 Staining Buffer Set固定破膜剂(560409)均购自美国BD Biosciences公司。CO2培养箱(美国Thermo 公司)，ALLEGRA X-15R离心机(美国Beckman公司), CantoⅡ流式细胞仪(美国BD公司)。

1.4 胞内流式细胞技术检测TH17/Treg细胞表达

1.4.1 标本前处理 收集结核性盆腔炎患者及健康育龄期女性空腹静脉血5 mL，肝素锂抗凝，取全血250 μL与750 μL含10%胎牛血清的1640培养基充分混匀，加入终浓度分别为50 ng/mL PMA、1 μg/mL离子霉素Ionomycin，震荡混匀后置于37 ℃、5% CO2、95%湿度条件下温育1 h，在培养体系中加入阻断因子Brefeldin A(终浓度10 μg/mL)，置于37 ℃、5% CO2、95%湿度条件下温育5 h。

1.4.2 流式分析 取经上述刺激后的血标本，加入1×FACS Lysing Solution溶血素3 mL，置于4 ℃溶血5 min，1 500 r/min离心5 min，去上清；加入预冷PBS 3 mL，1 500 r/min离心5 min，弃上清；加入Permeabilizing Solution试剂A 200 μL，置于4 ℃固定20 min，预冷PBS洗涤1次；加入1×Permeabilizing Solution试剂B 100 μL，重悬细胞，分别加入CD3-APC/CD8-PerCP/Foxp3-PE/IL-17-Alexa Fluor®700小鼠抗人单克隆抗体各5 μL，4 ℃避光温育1 h，预冷PBS洗涤1次，离心弃上清，加入200 μL PBS重悬，用BD canto Ⅱ流式细胞仪检测，Diva软件对结果进行分析，共收集106个细胞。采用CD3+CD8-细胞反圈门方法反映CD4+T 辅助细胞亚群的情况，根据FSC和SSC圈出淋巴细胞，然后根据CD3和CD8圈出CD3+CD8-细胞，以此代表CD4+T 辅助细胞亚群，并进一步分析该群细胞IL-17/Foxp3表达的情况。

1.5 统计学分析 用SPSS 13.0统计软件进行。计量资料多组样本间比较用方差分析，两组样本间采用两样本的t检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 结核性盆腔炎患者外周血TH17/Treg细胞表达水平 经非特异性刺激后结核性盆腔炎患者TH17细胞比例为(3.26±1.30)%，对照组为(4.92±1.71)%，差异有统计学意义(t=5.091，P<0.01)；此外，结核性盆腔炎患者Treg细胞比例为(5.18±1.53)%，明显高于对照组的(3.26±1.10)%，差异有统计学意义(t=6.577，P<0.01)。见图1。

注：A，结核性盆腔炎患者;B,健康人对照组。

图1 结核性盆腔炎患者和健康人对照外周血TH17细胞流式检测结果

2.2 抗结核治疗3、6个月后TH17/Treg细胞的变化情况 与治疗前比较，治疗3个月后TH17细胞及Treg细胞升高不明显，但治疗6个月后明显升高(P<0.01)。此外，与治疗前比较，治疗3个月TH17/Treg比值差异无统计学意义(P>0.05)，治疗6个月与治疗前及治疗3个月相比差异均有统计学意义(P均<0.01)。见表1。

表1 抗结核治疗3、6个月TH17/Treg细胞的变化情况

注：与对照组比较，a，P<0.05；与治疗前组比较，b，P<0.05；与治疗3个月组比较，c，P<0.05。

3 讨论

本研究检测了结核性盆腔炎患者外周血TH17的表达水平，发现患者TH17细胞数量明显低于对照组，说明TH17细胞除了在肺结核患者体内受到抑制外，在结核性盆腔炎患者体内同样受到抑制[5]。另有学者发现TH17细胞减少的数量与结核感染严重性成正比[6]。本研究通过对28例患者抗结核治疗的随访发现，随着疗程的增加，TH17细胞呈逐渐上升的趋势，抗结核治疗3个月变化不明显，治疗6个月后TH17细胞基本恢复到正常水平，从另一个角度说明TH17细胞在抗结核免疫中起到一定的保护作用。Treg细胞作为免疫调节细胞，在结核患者中起免疫抑制作用，其一方面通过抑制TH1细胞免疫反应,导致IFN-γ、IL-2分泌的减少,削弱机体免疫系统对感染结核分枝杆菌的清除,使结核感染慢性化[7]，另一方面通过抑制TH2细胞免疫反应，导致Treg对TH1 细胞的免疫抑制强于TH2细胞,从而致使结核患者的免疫失衡[8]。本研究发现结核性盆腔炎患者Treg表达水平明显高于对照者，治疗3个月后，Treg细胞有一定程度的下降，继续治疗6个月时，Treg细胞明显下降，但尚未下降至健康者水平。此外，本实验中检测到的Treg细胞为PMA刺激后Foxp3+的细胞，检测结果高于肺结核外周血未刺激的CD4+CD25+Foxp3+水平[2]，但低于张影等[9]在肺结核外周血中直接检测的CD4+CD25+CD127lowTreg细胞水平，且抗结核治疗后该群Treg细胞的一直处于较高水平。因此我们推测PMA刺激后的Treg细胞可能无法反映患者体内天然Treg细胞的状况，但TH17细胞的数量和抗结核治疗的变化情况与本实验结果是一致的。治疗前患者TH17/Treg的比值明显降低，有效治疗后逐渐升高，TH17/Treg失衡现象得到明显改善。结果提示结核病的发生不仅与传统的TH1/TH2细胞的失衡有关，TH17/Treg失衡在结核感染中同样发挥着重要作用，数量过高、功能过强的Treg细胞不仅抑制了TH1 细胞的抗结核作用。更重要的是抑制和削弱了TH17细胞的保护性细胞免疫反应，最终导致结核病的进展。

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(本文编辑：许晓蒙)

Analysis on TH17/Treg cells in patients with pelvic tuberculousis

LIUYu-juan1a,CAIQiu-e1a,ZHANGJie-yun1b,ZHUXiu-yun1b,ZHANGMing-xia1b,CHENXian-xiong2

(1a.DepartmentofObstetricsandGynecology, 1b.ResearchInstitute,TheThirdPeople′sHospitalofShenzhen,Shenzhen518112,Guangdong; 2.LaboratoryCenter,ShenzhenUniversitySchoolofMedicine,Shenzhen518060,Guangdong,China)

Objective To investigate the cellular immunologic response of TH17/Treg cells in the peripheral blood of pelvic tuberculosis patients and explore their roles in the pathogenesis of pelvic tuberculosis. Methods The intracellular flow cytometry was performed to evaluate the expressions of TH17 and Treg cells in 46 pelvic tuberculosis patients and 25 healthy controls in childbearing age. Twenty-eight of the 46 pelvic tuberculosis patients were followed up to monitor the variation of the TH17/Treg cells after 3 months and 6 months of anti-tuberculosis treatment. Results The percentage of TH17 cells in the peripheral blood of pelvic tuberculosis patients was (3.26±1.30)% which was significantly lower than that of healthy controls [(4.92±1.71)%,P<0.01]. The percentage of Treg cells in the patients was (5.18±1.53)% which was significantly higher than that of healthy controls [(3.26±1.10)%,P<0.01]. The percentage of TH17 cells in the pelvic tuberculosis patients after 6 months of treatment was (4.67±1.75)% which was significantly higher than that in the patients before treatment and after 3 months treatment [(3.26±1.30)%,P<0.01 and (3.70±1.06)%,P<0.01, respectively]. The percentage of Treg cells in pelvic tuberculosis patient after 6 months of treatment was (3.93±0.94)% which was significantly lower than that in the patients before treatment and after 3 months of treatment [(5.18±1.53)%,P<0.01 and (4.94±1.51)%,P<0.01, respectively]. The percentage of Treg cells in the patients after 6 months of treatment was still significantly higher than that of controls (P<0.05). The TH17/Treg ratio before treatment was significantly lower than that of healthy controls (P<0.01), and the TH17/Treg ratio was increased after 3 months of treatment but it did not show significant difference compared with that before treatment. The TH17/Treg ratio after 6 months of treatment (1.18±0.34)% was significantly increased in contrast to those after 3 months of treatment and before treatment [(0.77±0.21)%,P<0.01 and (0.55±0.13)%,P<0.01, respectively]. The TH17/Treg ratio could not rise to the normal level even after 6 months of treatment. Conclusion Both the TH17 and Treg cells may involve in the immunologic responses of pelvic tuberculosis patients and the imbalance of TH17/Treg cells may remain persistently.

pelvic tuberculosis; TH17 cell; Treg cell; flow cytometry

10.13602/j.cnki.jcls.2017.05.04

国家自然科学基金面上项目(81172732)；广东省自然科学基金项目(2015A030313879)；深圳市科技计划项目(JCYJ20150402111430653)。

刘玉娟,1971年生，女，副主任医师，大学本科，主要从事妇产科感染性疾病的研究。

陈献雄，高级实验师，硕士，E-mail：gzcxx@szu.edu.cn。

R52；R711.33

A

2017-02-12)