IL-17基因多态性位点与新疆地区慢性阻塞性肺病的风险关系*

徐丹，李风森，龚理，李争，荆晶，王晶

(新疆医科大学附属中医医院 a.国家中医临床研究基地，b.呼吸科，c.新疆呼吸病研究实验室，乌鲁木齐 830000)

·临床实验研究·

IL-17基因多态性位点与新疆地区慢性阻塞性肺病的风险关系*

徐丹a，李风森a，龚理b，李争a，荆晶a，王晶c

(新疆医科大学附属中医医院 a.国家中医临床研究基地，b.呼吸科，c.新疆呼吸病研究实验室，乌鲁木齐 830000)

目的 探讨IL-17基因核苷酸多态性与新疆地区慢性阻塞性肺病(COPD)的风险关系。方法 采用多重单碱基延伸单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)分型技术(SNaPshot)对149例COPD患者及97例健康人IL-17A基因rs2275913、rs3819024、rs3819025、rs4711998、rs8193036 5个SNP位点及IL-17F基因rs12203582、rs1266828、rs7771466、rs9382084 4个SNP位点进行分型，并比较不同基因型和等位基因与COPD的风险关系。结果 健康人与稳定期COPD患者在IL-17A的5个SNP位点及IL-17F的4个SNP位点均未见差异。其位点的变异、突变基因型分布与COPD的易感性亦无明显差异，对IL-17F及IL-17A基因的SNP进行连锁不平衡反应后的分析结果表明，IL-17A基因CAA单体型在COPD与健康人间差异存在统计学意义(OR=0.244，95%CI：0.057～1.043，P<0.05)。结论IL-17F及IL-17A基因多态性与COPD患病无直接风险关系，但在IL-17A基因单体型CAA改变可能与新疆地区COPD易感性有关。

慢性阻塞性肺病；IL-17；基因多态性

慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease，COPD)主要危险因素是遗传与环境共同作用的结果。基于对COPD 病理遗传机制研究的不断深入，目前研究的候选基因主要参与水解和抗水解、氧化和抗氧化、炎症反应、有毒物质代谢、气道高反应性和主动防御机制等[1-2]。研究资料显示，IL-17A、IL-17F均能刺激COPD患者气道上皮细胞产生多种细胞因子和炎性介质[3-4]，且COPD患者IL-17的含量与气道平滑肌增生程度及结缔组织增生程度存在相关性。目前国内外对IL-17基因多态性与COPD易感性的报道较少。本研究旨在分析新疆地区人群IL-17A、IL-17F基因多态性及单倍型的特点，探讨该基因多态性与COPD患者的风险关系，以期为COPD的防治提供依据。

1 材料与方法

1.1 研究对象 收集2014年1-12月于新疆医科大学附属中医医院门诊及住院的稳定期COPD患者149例，男92例，女57例，年龄(65.5±12.2)岁；收集同期体检健康者97例，男59例，女38例，年龄(63.7±10.2)岁。两组在年龄及性别上差异无统计学意义，且均来自新疆地区。COPD患者中汉族81例,维吾尔族35例，回族19例，哈萨克族9例，其他民族5例，健康人对照组中汉族59例，维吾尔族21例，回族7例，哈萨克族3例，其他民族7例。纳入标准[5]：(1)根据临床表现、危险因素接触史、体征及肺功能测定等资料确诊为COPD，(2)慢性咳嗽、咳痰和(或)呼吸困难及危险因素接触史；存在不完全可逆性气流受限(用支气管舒张剂后FEV1/FVC<70%)。排除标准：(1)合并气胸、肺癌、肺结核等其他严重肺部疾病者，(2)合并严重心脑血管、肝肾和造血系统等原发性疾病者，(3)精神病患者，(4)妊娠及哺乳期妇女。本研究经医院医学伦理学委员会批准，患者知情同意。

1.2 主要试剂及仪器 核酸蛋白定量仪(K5500，北京凯奥公司)，多用电泳仪电源(BG-Power3500，北京百晶公司)，凝胶成像系统(BioDoc-IT Imaging System，美国UVP公司)，紫外分析装置(FR-110，上海复日科技公司)，2720型Thermal Cycle热循环仪，ABI3730XL测序仪(美国ABI公司)，血液基因组DNA提取系统(非离心柱型)(DP319-02，北京天根公司)。琼脂糖(AB0013)、50×TAE(SD8108)溴酚兰(批号：B0312-5g)购自上海生工公司，溴化乙锭(E8751)、6×Loading buffer(9156)、DL 2 000 DNA Marker(批号：3427A)均购自TaKaRa公司，HotStarHiFidelity Polymerase Kit热启动高保真酶(批号：202605，Qiagen公司)，虾碱酶(SAP)(批号：M9910，Promega公司)，外切酶I(EXO-I、批号：#EN0581，Thermo公司)，Hi-DiTMFormamide(批号：4311320)、SNaPshot®Multiplex Kit(批号：4323161)、GeneScanTM-120 GeneScan(批号：4324287)均购自ABI公司，DNA提取试剂盒(批号：DP319-02)、DNA纯化试剂盒(批号：DP319-02)均购自北京天根公司。

1.3 基因组DNA提取 采集COPD患者及健康人空腹静脉血2 mL，EDTA-Na2抗凝，用DNA提取试剂盒提取基因组DNA，样本置-80 ℃保存。

1.4 PCR及测序鉴定 采用多重单碱基延伸单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)分型技术(SNaPshot)对IL-17A基因rs2275913、rs3819024、rs3819025、rs4711998、rs8193036 5个SNP位点及IL-17F基因rs12203582、rs1266828、rs7771466、rs9382084 4个SNP位点进行分型。根据GenBank中基因的序列号[IL-17A(NC_000006.12)，IL-17F(NC_000006.12)],用Primer Premier 5.0软件设计引物，并送上海生工公司合成，各SNP位点的引物见表1，延伸引物序列见表2。

表1 引物序列及产物片段大小

PCR总反应体系为25 μL，包括10 μmol/L上、下游引物各1 μL，10 μmol/L dNTPs 4 μL,10×PCR buffer 1 μL，模板DNA 2 μL，无菌ddH2O补足体积。采用Touch-down PCR，循环参数：95 ℃预变性2 min；95 ℃ 20 s，65 ℃ (每个循环退火温度降低0.5 ℃)40 s，72 ℃ 1.5 min，共11个循环,95 ℃ 20 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 1.5 min，共24个循环；72 ℃ 2 min，4 ℃保存。PCR产物纯化反应：10 μL PCR产物中加入5 U SAP酶和2 U Exonuclease I酶，37 ℃温浴1 h,75 ℃灭活15 min。延伸产物纯化在10 μL延伸产物中加入1 U SAP酶，37 ℃温浴1 h,然后75 ℃灭活15 min。延伸产物检测采用ABI 3730XL测序仪及GeneMapper 4.1软件(美国Applied Biosystems公司)分析。

表2 延伸引物序列

2 结果

2.1 对照组与COPD组IL-17A与IL-17F基因多态性分析 结果显示，健康人与稳定期COPD患者在IL-17A5个SNP位点及IL-17F4个SNP位点表达差异无统计学意义。见表3。Logistic 回归分析结果显示，rs4711998基因型位点在共显性模型下，与野生纯合型AA携带者相比，GG纯合型携带者与COPD患病风险显著相关(OR=2.947，95%CI：1.080～8.888，P=0.034)，其余位点的变异与COPD的易感性以及突变基因型分布与COPD的发病无明显关系。

表3 COPD患者与健康人IL-17A及IL-17F 基因型及等位基因型频率分析[n(%)]

续表

2.2 连锁不平衡分析

2.2.1IL-17F基因4个SNP连锁不平衡分析IL-17F基因rs7771466、rs12203582、rs9382084 和rs1266828 4个多态性位点连锁不平衡分析显示，无论在对照组还是在COPD组连锁不平衡系数|D′|均>0.5，表明 4 个 SNP 位于同一个单体型区域，该4个SNPs可以构建单体型。IL-17F基因单体型分析见表4。

表4 IL-17F基因单体型分布频率[n(%)]

2.2.2IL-17A基因3个SNP连锁不平衡分析IL-17A基因rs8193036、rs3819024和rs2275913多态性位点连锁不平衡分析显示，无论在对照组还是在CPOD组连锁不平衡系数|D′|均>0.5，表明 3 个 SNP 位于同一个单体型区域，这3个SNPs可以构建单体型。其余2个位点与rs8193036、rs3819024和rs2275913多态性位点的连锁不平衡系数|D′|均<0.5，尚不能构成基因单体型。通过连锁不平衡反应，显示IL-17A基因单体型CAA在COPD与健康人差异有统计学意义(OR=0.244，95%CI：0.057～1.043，P<0.05)。见表5。

表5 IL-17A基因单体型分布频率[n(%)]

3 讨论

研究表明，遗传因素在COPD的发病及发展过程中具有重要作用，COPD患者的部分基因可以影响患者对周围环境的敏感性，从而导致该疾病的易感性[6]。但目前已证实的遗传基因对COPD的影响报道不一。本课题组前期研究结果也显示IL-17在COPD大鼠模型气道呈高表达状态。因此，本研究对IL-17A、IL-17F基因多态性的差异进行分析，探讨该基因与COPD的易感性及风险性是否存在一定的关联。

本研究用SNaPshot技术检测IL-17A及IL-17F的多个SNP位点的基因型，结果发现IL-17A及IL-17F的基因型及等位基因频率分布COPD组与对照组间差异无统计学意义，推测其位点与COPD的易感性无明显相关关系。Logistic回归分析结果显示，仅IL-17Ars4711998基因型位点在共显性模型下，与野生纯合型AA携带者相比，GG纯合型携带者与COPD患病风险显著相关(OR=2.947，95%CI：1.080～8.888，P=0.034)，进一步对IL-17F及IL-17A基因的SNP进行连锁不平衡反应，单体型分析结果显示，IL-17F基因AGTA、CATA、CGGA、CGGG、CGTA 5种单体型在COPD组与对照组差异无统计学意义，而IL-17A单体型CAA在COPD与健康人对照间差异有统计学意义(OR=0.244，95%CI：0.057～1.043，P<0.05)，提示IL-17A基因单体型CAA与COPD患者的易感性存在相关性。CAA可能使COPD患者的保护单倍型。

本研究并未发现IL-17A、IL-17F的基因型及等位基因与COPD存在相关性，推测与下列因素有关：(1)人种差异：在不同的人种同一基因位点的多态性分布可能存在差异，新疆为少数民族大聚集的地方，民族多样化，可能影响基因的分布。(2)样本数量：本研究样本量适中，但进行亚组分析样本量较少，未对患者种族及表型、症状严重程度进行等分层比较。(3)IL-17A、IL-17F基因位点较多，各位点之间存在连锁不平衡，不能明确起决定性的基因位点。尽管本研究未能发现COPD患者与健康人对照组间IL-17F及IL-17A基因分布及等位基因频率分布差异存在统计学意义，但在IL-17A基因单体型CAA改变可能与新疆地区COPD易感性有关，可能具有降低新疆各民族患COPD的风险。IL-17A基因单体型CAA改变可能使IL-17A对机体的影响加强从而增加呼吸道炎症的产生和持续，使得COPD疾病的发生有易感趋势。本研究下一步将增加样本量，并对COPD患者进行严重程度及新疆少数民族进行分层研究，从而探索新疆地区COPD患者的基因水平的易感性及风险相关性，为疾病的诊断及预防提供更多的试验依据。

[1]SeifartC,Plagens A.Genetics of chronic obstructive pulmonary disease[J]．Int J Chron Obstruct Pulmon Dis,2007,2(4):541-50.

[2]Bosse Y．Genetics of chronic obstructive pulmonary disease:a succinct review,future avenues and prospective clinical applications[J]．Pharmacogenomics,2009,10(4):655-667．

[3]Ganjalikhani HM,Gheadi K,Andalib A,etal.Optimization of human Th17 cell differentiatiom in vitro:Evaluating different polarizing factors in vitro[J].Cell Dev Biol Anim,2011,47(8):581-592.

[4]Newcomb DC,Peebles RS.Th17-mediated in inflammation in asthma[J].Curr Opin Immunol,2013,25(6):755-760.

[5]GOLD Executive Committee.Global strategy for the diagnosis,management,and prevention of chronic obstructive pulmonary disease (Revised 2011)[OEB/OL].2011. www.goldcopd.org.

[6]Anto JM, Vermeire P, Vestboz J,etal.Epidemiology of chronic obstructive pulmonary disease[J].Eur Respir J,2001,17(5): 982-994.

(本文编辑：许晓蒙)

Correlation ofIL-17 gene polymorphism with chronic obstructive pulmonary disease in Xinjiang aera

XUDana,LIFeng-sena,GONGLib,LIZhenga,JINGJinga,WANGJingc

(a.NationalClinicalResearchBaseofTCM,b.DepartmentofRespiration,c.XinjiangKeyLaboratoryofRespiratoryDiseaseResearch,TraditionalChineseMedicineHospitalAffiliatedtoXinjiangMedicalUniversity,Urumqi830000,Xinjiang,China)

Objective To investigate the correlation ofIL-17 gene polymorphism with chronic obstructive pulmonary diseases (COPD) in Xinjiang area. Methods Five single nucleotide polymorphism (SNP) loci ofIL-17Agene, including rs2275913, rs3819024, rs3819025, rs4711998 and rs8193036, and 4 SNP loci ofIL-17Fgene such as rs12203582, rs1266828, rs7771466 and rs9382084 from 149 COPD patients and 97 healthy controls were performed typing using the multiple single-base extension SNP (SNaPshot) technology, and the risk correlations of different genotypes and alleles of these loci with COPD were analyzed. Results There was no difference in the SNP of 5IL-17Agene loci and 4IL-17Agene loci between stable COPD patients and healthy controls, and the mutation and genotype distribution of these loci were not correlated with COPD susceptibility. However, the linkage disequilibrium analysis showed that there was significant difference in the distribution ofIL-17Agene haplotype CAA between COPD patients and healthy controls (OR=0.244, 95%CI: 0.057-1.043,P<0.05). Conclusion TheIL-17FandIL-17Agene polymorphisms are not correlated with the risk of COPD, but the haplotype CAA ofIL-17Agene may be related to the susceptibility of COPD in Xinjiang area.

chronic obstructive pulmonary disease; IL-17; genetic polymorphism

10.13602/j.cnki.jcls.2017.05.06

新疆维吾尔自治区科研机构创新发展专项资金(2014751005)。

徐丹，1983年生，女，主治医师，硕士，研究方向：中西医结合呼吸。

李风森，主任医师，教授，博士，E-mail：fengsen602@163.com。

R563

A

2017-02-23)