解聚素金属蛋白酶在自身免疫性关节炎中的表达及与疾病活动的相关性研究

毋静++邓家鑫++曲源++张玉萍++江珍兰++于清宏

【摘 要】目的：探讨解聚素金属蛋白酶家族是否参与了自身免疫性关节炎的发病过程。方法：检测自身免疫性关节炎患者外周血单个核细胞中解聚素金属蛋白酶的表达，与疾病的炎症活动指标及标志性抗体进行相关分析，关节炎类型包括类风湿关节炎、系统性红斑狼疮关节炎和其他结缔组织病关节炎。结果：与健康对照者相比，解聚素金属蛋白酶在类风湿关节炎、系统性红斑狼疮关节炎和其他结缔组织病关节炎中均升高，疾病的活动性指标具有相关性。结论：解聚素金属蛋白酶家族参与了自身免疫性关节炎的发病。

【关键词】 关节炎，自身免疫性；解聚素金属蛋白酶；ADAM8；ADAM15；ADAM19；疾病活动；相关性

On the Expression of Disintegrin Metalloproteinases in Autoimmune Arthritis and Its Correlation with Disease Activity

WU Jing，DENG Jia-xin，QU Yuan，ZHANG Yu-ping，JIANG Zhen-lan，YU Qing-hong

【ABSTRACT】Objective：To study the expression of disintegrin metalloproteinases in autoimmune arthritis and its correlation with disease activity.Methods：The expression of disintegrin metalloproteinases in peripheral blood mononuclear cells of patients with autoimmune arthritis was detected and its correlation with the inflammatory activity index and marked antibody was analyzed.The arthritis includes rheumatoid arthritis，systemic lupus erythematosus arthritis and other connective tissue disease arthritis.Results：Compared with the healthy controls，disintegrin metalloproteinases in the rheumatoid arthritis，systemic lupus erythematosus arthritis and other connective tissue diseases increased，which was associated with disease activity index.Conclusion：The family of disintegrin metalloproteinases involves in the pathogenesis of autoimmune arthritis.

【Keywords】 arthritis，autoimmune；disintegrin metalloproteinases；ADAM8；ADAM15；ADAM19；disease activity；correlation

自身免疫性關节炎为自身免疫性疾病的关节损害，症状包括关节疼痛、红肿、僵硬及受影响关节功能障碍，典型的自身免疫性关节炎包括类风湿关节炎（rheumatoid arthritis，RA）、系统性红斑狼疮关节炎（systemic lupus erythematosus arthritis，SLEa）和结缔组织病关节炎（connective tissue diseases arthritis，CTDa）。自身免疫性关节炎的发病机制仍然未完全清楚，但多项研究都表明基质金属蛋白酶参与了自身免疫性关节炎的发病。因此探究金属蛋白酶的新家庭成员——解聚素金属蛋白酶（A disintegrin and metalloproteinase，ADAMs）是否参与该类疾病的发病机制具有重要意义。ADAM8可以被软骨细胞合成，重组的ADAM8可以诱导软骨代谢[1]。RA患者关节滑液中性粒细胞ADAM8的表达增高，而且滑液中性粒细胞ADAM8的表达和关节炎症的程度具有相关性[2]，并且ADAM8也参与气道高反应性过敏反应及哮

喘[3]。这些研究都提示，ADAM8通过炎症反应通路参与多种炎症性疾病。ADAM15则主要在血管形成中起重要作用，并且在退行性关节炎的基质重构中具有重要作用[4-6]。ADAM15在RA滑膜细胞中表达升高[7-9]。ADAM19在CD4+细胞中高表达，相关研究表明，ADAM19在炎症性肠病和疱疹样皮炎的病灶中表达升高[10-12]。目前，很少有ADAMs与关节炎，尤其是免疫性关节炎相关性的研究。基于炎症性关节炎尤其是RA，滑膜增生与血管生成在疾病的早期起到重要作用，而ADAMs家族中多种成员参与血管形成。因此本研究针对ADAM8，15，19在关节炎尤其是免疫性关节炎中的表达及与疾病活动相关性为切入点进行

研究。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2015年1月至2015年12月在本院就诊的门诊或住院自身免疫性关节炎患者98例，其中RA患者50例，均符合美国风湿病学会（ACR）/欧洲抗风湿病联盟（EULAR）2009年

RA诊断标准；SLEa患者26例，均符合2009年系统性红斑狼疮国际协作组（SLICC）修改的ACR系统性红斑狼疮分类标准并且合并有关节炎症状；CTDa患者24例，均符合结缔组织病诊断标准并且合并有关节炎症状。另选择12名健康志愿者为健康对照组。

1.2 ADAM8、ADAM15、ADAM19 mRNA表达水平的检测方法 收集自身免疫性关节炎患者及健康对照组基础信息，包括临床资料及红细胞沉降率（ESR）、C-反应蛋白（CRP）、白细胞介素-6（IL-6）、类风湿因子（RF）及抗CCP抗体水平。采集自身免疫性关节炎患者及健康对照组外周血单个核细胞，采用ficoll梯度离心的方法分离各组外周血单个核细胞，将分离的研究者外周单个核细胞使用PBS清洗后加入1 mL Trizol试剂（Gibco公司），混匀，静置5 min；加氯仿200 μL静置

5 min，12 000 r·min-1离心机离心15 min；然后取上清加入500 μL异丙醇，静置10 min，12 000 r·min-1离心机离心10 min，弃去上清；750 mL·L-1乙醇洗涤离心弃去上清，干燥沉淀5～10 min，溶解总RNA于DEPC水。使用反转录试剂盒（PrimeScript，TAKARA）进行cDNA反转录，将反转录用的引物，dNTP mixture和模板RNA混合，65 ℃，5 min，4 ℃；添加primrscript Buffer酶和RNase抑制剂，30 ℃，10 min，40 ℃，15～30 min，95 ℃，5 min，4 ℃。将取得的DNA模板1 μL，参考realtime-PCR试剂盒（TAKARA的SYBR Premis Ex Taq TM）说明书进行PCR扩增，反应条件：预变性95 ℃，20 s，变性95 ℃，5 s，退火60 ℃，25 s，延伸72 ℃，1 s，40个循环；终末延伸70 ℃，0.01 s得到PCR产物。引物见表1。

1.3 统计学方法 采用SPSS 17.0软件进行统计分析。组间差异采用单因素方差分析或非参数检验；相关性检验采用person相关性分析。以P ﹤ 0.05为差异有统计学意义。

2 结 果

2.1 基本资料 实验对象分4组，RA组50例，男16例，女34例；年龄19～67岁，中位数44.1岁。SLEa组26例，男3例，女23例；年龄23～56岁，中位数41.5歲。CTDa组24例，均为女性；年龄21～60岁，中位数34.5岁。健康对照组12例，男3例，女9例；年龄28～40岁，中位数34.8岁。

2.2 ADAMs的表达 分析发现，ADAM8在自身免疫性关节炎中表达升高，见图1（1）；ADAM8在RA组、SLEa组和CTDa组均增高，而健康对照组的表达则较低，健康对照组和各关节炎组间差异均有统计学意义（P = 0.002 8），而各关节炎组之间差异无统计学意义（P = 0.09）。提示ADAM8虽然参与了多种自身免疫性关节炎的炎症过程，但并没有特异性关节炎高表达。

RT-PCR检测结果表明，与健康对照组相比，ADAM15在自身免疫性关节炎中增高（P = 0.004 1），

包括RA、SLEa以及CTDa，见图1（2）。相较于RA组，ADAM15尤其在自身免疫性疾病的代表性疾病SLEa中高表达，组间差异有统计学意义

（P = 0.002 2），而RA组和CTDa组之间差异无统计学意义（P = 0.675 4）。

与健康对照组相比，ADAM19在自身免疫性关节炎中表达增高（P = 0.000 1），与ADAM15相似，ADAM19在SLEa中高表达，见图1（3），组间差异有统计学意义（P = 0.007 1）。而RA组和CTDa组之间差异无统计学意义（P = 0.706 7）。

2.3 相关性分析 ADAMs和炎症相关性分析结果显示，ADAM8和CRP具有相关性，见图2，r = 0.252，P = 0.008，说明ADAM8与炎症反应具有相关性，这与ADAM8在所有关节炎中表达均升高结果一致，说明ADAM8的确参与了普遍的炎症反应，所有关节炎类型中均表达增高；另外，ADAM8与RA的抗CCP抗体也具有相关性，见图3，

r = 0.340，P = 0.004。ADAMs中的ADAM15和ADAM19

与自身免疫性关节炎的炎症活动指标没有明显的相关性，与疾病的标志性抗体也没有相关性。

3 讨 论

自身免疫性关节炎是一组引起关节病变和功能障碍的疾病，症状包括关节疼痛、红肿、僵硬及受影响关节功能障碍，典型的自身免疫性关节炎包括RA、SLEa和CTDa，自身免疫性关节炎的发展过程往往伴随着炎症过程，尤其是在疾病活动期，患者会表现出高的炎症活动水平，ADAMs家族参与了多种炎症疾病的发病过程；并且有证据证明ADAMs参与了自身免疫性炎症的形成过程，提示其在自身免疫性疾病的发生中起重要作用，因此探究ADAMs与自身免疫性关节炎的相关性和深层机制对此类疾病的防治具有重大（下转第21页）

（上接第7页）意义。本研究发现，ADAMs家族中ADAM8，15，19在自身免疫性关节炎患者外周血单个核细胞中的表达升高，提示其参与了自身免疫性关节炎的发病，尤其是ADAM8不仅参与了自身免疫性关节炎的发病过程，其和此类疾病的活动性指标具有相关性。ADAM15及ADAM19参与了多种自身免疫性关节炎的发病过程，在SLEa中的表达尤其升高。这提示ADAMs在自身免疫性关节炎中起到了重要作用，对ADAM8的调控可能起到控制关节炎发病的作用，尤其是炎症期。而ADAM15及ADAM19主要参与了SLE的发病，针对这两种ADAMs的调控可能起到控制SLE发病的作用。ADAM8，15，19在自身免疫性关节炎患者中高表达，使其成为研究自身免疫性关节炎的切入点之一，但还需要更多的研究支持，进一步探讨ADAMs如何参与自身免疫性疾病的发病过程，将为自身免疫性疾病的治疗带来新的方向。

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收稿日期：2017-01-12；修回日期：2017-03-13