人工感染异养硝化菌对小鼠肝脏酶活性影响

黄晓飞，李伟光，李建政，张多英，秦 雯，郑泽嘉

(哈尔滨工业大学 市政环境工程学院，哈尔滨 150090)



人工感染异养硝化菌对小鼠肝脏酶活性影响

黄晓飞，李伟光，李建政，张多英，秦 雯，郑泽嘉

(哈尔滨工业大学 市政环境工程学院，哈尔滨 150090)

为研究一株有较强硝化氨氮能力的异养型硝化菌对小白鼠体内各组织及肝脏谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)活性的影响.分别给予实验组小白鼠接种500 mg/kg、1 000 mg/kg菌体，在饲养15 d内，测定小白鼠肝脏中GPT和GOT的活性变化，并通过组织切片观察该菌体对小白鼠肝、肾、脾脏器的影响.结果表明, 注射500 mg/kg菌体造成小白鼠肝脏指数显著升高，随后有下降的趋势但是仍高于对照组，表明该菌体对小白鼠肝脏功能影响不大，注射1 000 mg/kg的菌体肝脏中GPT和GOT的活性先上升最终低于对照组，表明此实验的菌量给肝脏造成影响，观察小鼠组织切片发现，肝、肾、脾对该菌体的免疫应答与菌体作用时间有一定相关性，当超过一定限度后会引起各个脏器的改变.

异养硝化细菌；小白鼠；谷丙转氨酶；谷草转氨酶

随着我国经济的快速发展，城市污水的大量排放致使水体中氮素污染日益严重，脱氮成为水处理的重要研究内容，异养硝化菌在水体脱除氨氮方面是起重要作用，而微生物或其代谢产物可以残留于人和动物体内，产生蓄积毒性，导致多个组织器官系统出现中毒反应.关于异养硝化菌中毒和其毒性研究的报道很少[1-2]，本研究采用食品安全性毒理学评价中的短期喂养试验，选择ICR小白鼠作实验动物来检测异养型硝化细菌(Acinetobacter.Y20)对肝脏、肾脏、脾脏的蓄积毒性，为全面建立生物去除饮用水氨氮的生物安全性评价体系提供依据.

1 材料及方法

1.1 材料

1.1.1 菌株来源

本试验所研究的低温异养硝化细菌(Acinetobacter.Y20)来源于北方冬季松花江原水，经分离、纯化得到，现保留在哈尔滨工业大学市政工程研究中心-80 ℃冰箱中.

1.1.2 小白鼠来源

6周龄清洁级ICR小白鼠，购自哈尔滨兽医研究所.

1.2 方法

1.2.1 染菌途径

将纯化的细菌接种于异养硝化液体培养基中2 ℃需氧条件下培养5 d，离心收集菌体、生理盐水洗涤3次并配置成500 mg/kg(A组)、1 000 mg/kg(B组)，取小鼠90只，分成3组，标号A、B 、C，每组30只，雌雄各半，体重(15±2) g， A～B组为实验组，C组为不接种菌体的对照组，每只小鼠腹腔注射菌悬液0.4 mL，连续观察小白鼠生活情况.

1.2.2 酶活性测定

1)谷丙转氨酶(ALT/GPT)

将小鼠肝脏切下，准确称量组织总质量，制成1%的组织匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清液，按照试剂盒方法测定,得到各管OD值，代入标准曲线中求出相应的酶活力单位，代入计算公式：

组织中GPT活力(U/mgprot)=通过标准曲线得匀浆活力/待测组织匀浆蛋白浓度(mgprot/mL).

2)谷草转氨酶(ALT/GOT)

将小鼠肝脏切下，准确称量组织总量，制成1%的组织匀浆，3 500 r/min离心10 min，取上清液，按照试剂盒方法测定,得到各管OD值，代入标准曲线中求出相应的酶活力单位，然后代入计算公式：

组织中GPT活力(U/mgprot)=通过标准曲线得匀浆活力/待测组织匀浆蛋白浓度(mgprot/mL).

1.2.3 病理学检测

1)病理学剖检

饲喂15 d将小白鼠剖开腹部观察肝脏、肾脏、脾脏的病理变化.

2)病理组织学检查

切下小白鼠肝、肾、脾用生理盐水漂洗除去血液和其他污物，将脏器放入4%的甲醛固定12 h，按照组织切片常规技术洗脱，酒精系列脱水，二甲苯透明,石蜡渗透包埋，切片经HE染色，中性树脂封片后用光镜观察.

1.2.4 数据处理

数据结果表示为3次重复的平均值标准差，并应用SPSS 7.5对试验数据做方差分析.处理组和对照组之间的差异采用t检验进行分析．P<0.05为差异显著，P<0.0l为差异极显著

2 实验结果

2.1 腹腔注射

腹腔注射给药后，A实验组小白鼠均未出现中毒症状与对照组一样活动和正常采食，没有死亡小白鼠.B实验组小白鼠出现中毒症状，没有腹泻症状，但被毛竖立，弓背，食欲不振，沉默，活动减慢，在实验第三天和第四天各死亡2只，对其解剖镜检发现有少量菌体，脾脏出现肿大现象，其余各小白鼠活动正常.C组对照组小白鼠均活动正常，健康，在实验期间未出现异常，实验结束均健存.

2.2 肝脏谷丙转氨酶和谷草转氨酶测定

分别对A、B实验组和对照组小白鼠在1、3、5、9、11、15 d剖杀切取肝脏测定谷丙转氨酶(GOT)和谷草转氨酶(GPT)活性，每组取三只小白鼠进行数据分析，结果如图1、2.A实验组整个实验过程中实验组谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性均高于对照组，但在实验11 d时出现下降，B实验组谷丙转氨酶(GOT)和谷草转氨酶(GPT)活性的变化趋势相同，实验结束时谷丙转氨酶(GOT)活性比对照组低，说明该剂量对肝脏造成一定的损伤.

图1 染菌小白鼠肝脏谷丙转氨酶活力

图2 染菌小白鼠肝脏谷草转氨酶活力

2.3 小白鼠组织病理学检查

对A、B实验组和对照组小白鼠剖开腹部做肝脏、肾脏、脾做病理组织学检查，观察器官变化情况(如图3～14).图10A实验组小白鼠肝脏与图9对照组相比组织几乎未见异常，但也有轻微的肝细胞肿胀现象；图11B实验组肝组织出现细胞水肿，狄氏间隙增宽，肝血窦受压缩小，甚至闭锁，肝细胞肿胀，离散，体积增大，细胞内出现大小不等的水泡，原有的肝索结构消失(图B11).图14B实验组死亡小白鼠肝组织在肝组织内可见一些局灶性的区域肝细胞表现为坏死，细胞核浓缩或溶解消失，甚至原有的细胞组织轮廓消失，呈一片均质无结构的红染状态.脾脏图6实验组细胞间隙增大，脾索内细胞增多，出现免疫应答反应；图7B实验组有一定量的中性白细胞和多量巨噬细胞浸润和少量红细胞，图13B实验组死亡小白鼠脾髓内充盈大量血液，脾实质淋巴细胞、网状细胞弥漫性坏死、崩解而显著减少，在巨噬细胞和脾髓内有大量含铁血黄素沉积，表现为急性脾肿.图4A实验组小白鼠肾脏与对照组未见异常，图4B实验组肾间质水肿，肾小球毛细血管扩张充血，肿大.肾小囊内有一定量的炎性渗出液和炎症细胞浸润；图14B实验组死亡小白鼠肾小管上皮细胞肿胀，细胞核碎裂，浓缩，溶解消失，上皮细胞与基膜分离，大量红细胞弥散性分布在间质内.

图3 小白鼠对照组肾组织切片

图4A 实验组小白鼠肾组织切

图5B 实验组小白鼠肾组织切片

图6 小白鼠对照组脾组织切片

图7 A实验组小白鼠脾组织切片

图8 B实验组小白鼠脾组织切片

图9 小白鼠对照组肝组织切片

图10 A实验组小白鼠肝组织切片

图11 B实验组小白鼠肝组织切片

图12 B实验组死亡小白鼠肾组织切片

图13 B实验组死亡小白鼠脾组织切片

图14 B实验组死亡小白鼠肝组织切片

3 讨论与结论

3.1 异养硝化菌所致的肝脏损伤

肝脏是小白鼠营养物质消化的主要腺体，也是尿素合成的主要场所.谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性显著提高，能够加快尿素生成，减少氨基酸代谢产物对机体的毒害[1].通过谷丙转氨酶和谷草转氨酶活性的测定，结果表明这两种酶的活性在15 d都明显高于对照组，说明短时间异养硝化菌可诱导这两种酶活性提高，加强对毒物的排出.随着时间的延长这两种酶的活力都开始下降，并且随着异养硝化菌浓度的升高，活力也越来越小，到B实验组酶的活力已经明显低于对照组的活力.这说明肝细胞长期处于不良的状态下，功能开始下降[3].由此看出异养硝化菌对小白鼠肝脏的GPT、GOT活性变化与异养硝化菌浓度和暴露时间存在一定的剂量、时间效应关系.

肝脏也是行使主要的代谢、储存、解毒功能.各种有害因子和物质能以肝细胞作为靶细胞，激发肝细胞损伤.肝细胞损伤的机制很复杂，可分为化学性和免疫性肝损伤两类[3].异养硝化菌在较低的适宜浓度使用时，具有促进蛋白质同化作用，提高生物体免疫功能，本试验中即菌体质量浓度低于500 mg/L时，由于肝脏的储备能力强，无明显的临床症状和病理学损害，而异养硝化菌质量浓度高于1 000 mg/L；大部分鼠肝脏开始出现以实质器官变性为主的病理学变化.异养硝化菌剂量增大会不同程度抑制小鼠的增重[4].总蛋白和白蛋白均由肝细胞合成分泌进入血液，异养硝化菌致肝细胞损伤后会引起动物机体代谢紊乱，肝脏中谷丙转氨酶(GOT)和谷草转氨酶(GPT)活性均升高，使小鼠蛋白质合成代谢水平下降，同时连续大剂量使用异养硝化菌会使酶活性减弱.

3.2 异养硝化菌对小鼠肾脏毒性作用的探讨

肾脏是动物体内代谢产物排泄的主要器官，异养硝化菌内服经肠道吸收，再经过肝脏解毒作用后，异养硝化菌及其代谢产物主要从肾脏中排出体外.由此可推测，若异养硝化菌具有毒性作用，就可能对肾脏产生损伤作用.由病理学检查发现低剂量实验组在本试验中虽然没有表现出明显的临床症状，但并不能排除长期饲喂异养硝化菌产生的蓄积作用而造成的危害，因此若要确定药物的慢性毒性最好再延长饲喂时间；而高剂量实验组肾间质水肿，肾小球毛细血管扩张充血，肿大.肾小囊内有一定量的炎性渗出液和炎症细胞浸润等损害[5].

3.3 异养硝化菌对小鼠脾毒性作用的探讨

脾脏是人体最大的外周免疫器官，由白髓、红髓和边缘区构成，白髓由密集的淋巴细胞构成，可分为动脉周围淋巴鞘和脾小体两部.而动脉周围淋巴鞘是围绕在中央动脉周围的以T细胞为主的厚层淋巴组织.红髓有脾索和脾血宴构成.脾脏是对血源性抗原产生免疫应答的主要场所.在机体免疫功能中起重要的作用，随着异养硝化菌剂量的提高，免疫器官也发生明显的退行性改变，如脾脏红白髓界限不清楚，细胞间隙增大，脾索内细胞增多，有一定量的中性白细胞和多量巨噬细胞浸润和少量红细胞，淋巴细胞稀疏紊乱.实验结果显示，当机体有抗原摄入时，会使脾脏产生大量的免疫细胞，维持自身稳定.

4 结 语

小白鼠注射低温异养型硝化细菌(Acinetobacter.Y20)500 mg/kg菌体造成小白鼠肝脏指数显著升高，随后有下降的趋势但是仍高于对照组，表明该菌体对小白鼠肝脏功能影响不大，而注射1 000 mg/kg的菌体肝脏中谷丙转氨酶(GPT)和谷草转氨酶(GOT)的活性先上升最终低于对照组，表明此实验的菌量给肝脏造成影响.通过观察小白鼠体内各组织切片发现，肝、肾、脾对该菌体的免疫应答与菌体作用时间及剂量有一定相关性，当超过一定限度后会引起各个脏器的改变.

[1] 赵 杰, 谷子林, 崔青曼, 等. “克白克”对中国对虾体内琥珀酸脱氢酶、磷酸甘油三酯和谷草转氨酶活性的影响[J]. 中国饲料, 2002(3): 3l-32.

[2] 汪开毓, 耿 毅, 钟妮娜. 鱼类应激性出血症的病理学研究[J]. 淡水渔业, 2000, 30(11): 25-31.

[3] LASSER M R, PAYEN D. Mechanisms of liver amage [J]. Semin-Liver-Dis, 1996, 16(4): 357-367.

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Artificial infected heterotrophic nitrifying bacteria effects on activity of enzyme in mice’s liver

HUANG Xiao-fei, LI Wei-guang, LI Jiang-zheng, ZHANG Duo-ying, QIN Wen, ZHENG Ze-jia

(Harbin Institute of Technology, School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin 150090, China)

The purpose of this paper is to study the heterotrophic nitrifying bacteria (Acinetobacter.Y20), a sort of bacteria with the strong ability of nitrifying ammonia, effects on the activity of glutamic-pyruvic transaminase (GPT) and glutamic-oxalacetic transaminase (GOT) in mice’s organizations and Liver. The mice were given to vaccinate 500 mg/kg, 1000 mg/kg bacteria, in feeding within 15 d, determining the mice liver GPT and GOT changes of activity and through the biopsy observe the bacteria to mouse liver and kidney, the influence of the internal organs of the spleen. The results showed that the injection of 500 mg/kg bacteria cause small mice liver index significantly increased and decreased over the trend but still higher than those in the control group, show that the bacteria to mouse liver function the impact was not great, and inject 1 000 mg/kg of the bacteria in the liver Alt GPT and GOT activity first rise eventually lower than those of the control group, showed that the experiment of the bacteria cause damage to the liver. Through the observation of mice every biopsy found, liver, kidneys, spleen of the bacteria immune response and bacteria have certain correlation function time, when more than a certain limit will cause the after organs to change.

heterotrophic nitrifying bacteria; mice; glutamic-pyruvic transaminase; glutamic-oxalacetic transaminase

2016-10-15.

国家自然科学基金(51578178)

黄晓飞(1976-)，女，博士，讲师，研究方向：水处理技术.

李伟光(1962-)，男，博士，教授，研究方向：水处理工艺理论与技术. 李建政(1965-)男，博士，教授，研究方向：环境工程与水处理技术.

R994

A

1672-0946(2017)03-0272-05