半枝莲多糖对胃癌细胞SGC—7901的细胞活性影响

高山+宋高臣+许晓义

【摘要】 目的：研究半枝莲多糖（scutellaria barbata polysaccharides，SBP）对胃癌细胞SGC-7901细胞活性的影响。方法：利用不同质量浓度半枝莲多糖处理SGC-7901胃癌细胞，对SBP处理后的SGC-7901进行细胞计数，利用MTT法检测半枝莲多糖对胃癌细胞SGC-7901的细胞活性的影响；采用荧光定量RT-PCR对SGC-7901细胞中的野生型P53基因的表达进行检测。结果：经SBP处理后胃癌细胞SGC-7901的细胞数明显减少，SBP对SGC-7901的细胞活性的抑制呈剂量依赖性，其中20 μg/ml SBP组的活性抑制率最高，野生型P53基因表达量随SBP质量浓度升高而增加，10、20 μg/ml SBP组P53基因的表达量高于阴性对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。结论：半枝莲多糖通过上调抑癌基因P53以抑制胃癌细胞SGC-7901的生长活性。

【关键词】 半枝莲多糖； 胃癌； 增殖抑制； 基因表达调控； 细胞培养

doi：10.14033/j.cnki.cfmr.2017.15.001 文献标识码 A 文章编号 1674-6805（2017）15-0001-02

Influence of Scutellaria Barbata Polysaccharide on the Cell Activity of Gastric Carcinoma Cell SGC-7901/GAO Shan，SONG Gao-chen，XU Xiao-yi.//Chinese and Foreign Medical Research，2017，15（15）：1-2

【Abstract】 Obejective：To study the effect of SBP（scutellaria barbata polysaccharides） on SGC-7901 gastric cancer cellular activity.Method：SGC-7901 gastric carcinoma cell was handled with SBP in different mass concentration，the cellular activity that SGC-7901 under the treatment of SBP was observed by MTT，the expression of wt-P53 gene was detected in SGC-7901 including which cultured by SBP.Result：The count of SGC-7901 which had been handled by SBP reduced significantly， the depression of cellular activity had dose-dependent，the most obvious depressive activity was in the 20 μg/ml SBP group，the level of wt-P53 expression in SBP cultured SGC-7901 cell group elevated with the increase of mass concentration of SBP.The level of P53 expression in the 10 and 20 μg/ml

SBP group were higher than the negative control，the differences were statistically significant（P<0.01）.Conclusion：SBP depresses the growth of SGC-7901 gastric tumor cell by upregulating P53 gene.

【Key words】 Scutellaria barbata polysaccharides； Gastric cancer； Depression of proliferation； Regulation of genome expression； Cell culture

First-authors address：Mudanjiang Medical University，Mudanjiang 157011，China

半枝蓮（Scutellaria barbata），作为一种民间常用中草药，其性寒，味辛、苦，具有清热解毒、散癖止血、利尿消肿等功效，常用于治疗咽喉肿痛、跌打伤痛、疗疮肿毒、水肿、黄疽、蛇虫咬伤等[1]。现代研究及临床数据证明，半枝莲具有良好的抗肿瘤活性，疗效确切，主治原发性肝癌等消化道肿瘤、肺癌及宫颈癌等妇科肿瘤[2]。半枝莲多糖（Scutellaria barbata polysaccharides，SBP）是半枝莲中的重要多糖成分，前期研究发现其具有对化疗药物环磷酰胺的增效减毒作用以及对肝癌SMMC-7721明显的生长抑制作用。本研究通过对半枝莲多糖对胃癌细胞SGC-7901细胞生长活性及其对野生型P53抑癌基因影响的研究，以探索半枝莲多糖对胃癌细胞的生长抑制作用。

1 材料与方法

1.1 实验材料

SGC-7901胃癌细胞株（中国科学院上海细胞所细胞库），RPMI 1640培养基（Hyclone）；FBS胎牛血清（solar bio）；胰酶（solar bio）；噻唑蓝（MTT，Sigma）；DMSO（Sigma）；96孔细胞培养板；半枝莲粗多糖（黑龙江中医药大学生化教研室制备）；总RNA提取试剂盒（ThermoFisher）；Taq DNA Polymerase（合生基因）；SYBR ExScriptYMRT-PCR Kit（中国Gene Pharma 公司）；引物（上海生工生物工程有限公司合成）。

1.2 方法

1.2.1 半枝莲多糖的制备 取半枝莲粗多糖干燥粉末按照1∶4的比例在45 ℃温水中浸提2 h。加入4倍体积95%乙醇搅拌，室温静置6 h，离心（12000 rpm，15 min）收集沉淀；沉淀经乙醚去脂、氨水脱色、三氯乙酸法脱蛋白，重复实验并以硫酸-苯酚法跟踪检测，保证多糖含量在90%以上。将沉淀用蒸馏水溶解，在液氮中冷冻8 h后取出，用冻干机冷冻48 h，取出冻干粉，将冻干粉溶于适量蒸馏水中，用无菌滤膜过滤器过滤除菌两次，收集滤液并计算浓度，过滤过程采用无菌操作。

1.2.2 细胞培养 用含10%胎牛血清的RPMI-1640培养基培养SGC-7901胃癌细胞株，在37 ℃、5%CO2环境下的细胞培养箱中进行传代。取呈对数生长的细胞用于实验。

1.2.3 半枝莲多糖对细胞生长的影响 将对数生长的SGC-7901胃癌细胞用胰酶（EDTA）消化后制备细胞悬液，并将其以每孔细胞浓度为5×103个接种于96孔细胞培养板中，培养24 h使细胞充分贴壁。种板后在已接种的孔内加入不同浓度的半枝莲多糖（SBP）溶液，并使孔中药物质量浓度分别达到20、10、5、2.5 μg/ml，RPMI-1640培养基为阴性对照组，每组设5个复孔，在培养箱培养48 h，后进行细胞计数。经MTT法处理后[3]，在490 nm波长处测定吸光度，计算不同质量浓度的半枝莲多糖对SGC-7901的生长抑制率：p抑制（%）=（1-D药物组/D对照组）×100%。式中：D为样品在490 nm波长下的吸光度。

1.2.4 胃癌细胞中P53基因的表达 将对数生长的SGC-7901细胞悬液以细胞浓度5×106个/ml分别加入5个培养瓶中，以药物质量浓度为0、2.5、5、10、20 μg/ml分别加入各个培养瓶中，置于培养箱中培养5 d。用总RNA提取试剂盒提取RNA。取1 μg总RNA进行荧光定量RT-PCR扩增P53基因。P53上游引物：TGTGGAGTATTTGGATGACA，下游引物：GAACATGAGTTTTTTATGGC；内参基因β-actin上游引物：GAGACCTTCAACACCCAGCC，下游引物：GCGGGGCATCGGAACCGCTCA。反应体系为25 μl，反应条件：42 ℃反转录1 h，94.0 ℃预变性5 min，94.0 ℃变性45 s，55.0 ℃退火1 min，72.0 ℃延伸2 min，80.0 ℃收集荧光30 s，共35个循环。根据CT值分析P53基因的表达[4]。

1.3 统计学处理

选用SPSS 13.0统计软件进行实验结果分析，计量资料以（x±s）表示，比较用单因素方差分析，P<0.01表示差异有统计学意义。

2 结果

2.1 各组药物质量浓度对SGC-7901生长的影响

细胞个数随药物质量浓度升高而递减，见图1。各SBP组细胞在490 nm波长的吸光度均明显低于阴性对照组，差异具有统计学意义（P<0.01），质量浓度20 μg/ml的半枝莲多糖对胃癌细胞SGC-7901抑制作用最强，见表1。

2.2 半枝莲多糖干预后的SGC-7901胃癌细胞P53基因的表达

荧光定量RT-PCR结果表明，半枝莲多糖对抑癌基因P53的表达具有明显的上调作用，其表达量随药物质量浓度升高而增加，与阴性对照组相比，各剂量组的上调倍数分别为1.06、1.31、1.08、2.06倍，其中，在20 μg/ml SBP组中P53上调结果最为明显，10、20 μg/ml SBP组P53基因的表达量高于阴性对照组，差异有统计学意义（P<0.01），见表2、图2。

3 讨论

胃癌是威胁人类健康的恶性肿瘤之一，其发病因素广泛且机制复杂，临床上多采用外科手术与放化疗联合的方法进行治疗，但是创伤大、复发率高等诸多不足仍然是困扰医学工作者的难题[5]。中药多糖作为中草药的有效成分之一在近年来也是国内的研究热点，众多研究表明中药多糖对胃癌细胞的生成、转移、凋亡等诸多阶段有不同的作用，韩澄等[6]发现青钱柳多糖能抑制胃癌MGC803细胞生长，并促使其凋亡；吉爱军等发现树舌多糖通过抑制胃癌细胞SGC-7901中的Cyclin D1、P16的表达来发挥其对肿瘤细胞的抑制作用[7]。

P53基因是一种重要的抑癌基因，分为野生型和突变型，野生型即正常的P53基因（wt-P53），主要通過产生P53蛋白来调控细胞的增值过程以防止细胞发生癌变[8]。P53与多数靶基因的表达有关，并影响肿瘤细胞周期、分化、转移、凋亡、DNA损伤等诸多作用[9]。

本研究结果表明：胃癌细胞SGC-7901在半枝莲多糖的作用下细胞数目减少，在细胞活性方面，不同质量浓度的半枝莲多糖均可抑制SGC-7901的细胞活性，并随计量增大而活性降低。在基因水平的研究中，不同质量浓度的半枝莲多糖干预后的SGC-7901细胞，其野生型P53基因的表达量随药物质量浓度的升高而增加，其中，在20 μg/ml半枝莲多糖干预下的SCG-7901细胞P53基因表达量是无药物干预时的2.06倍，10、20 μg/ml SBP组P53基因的表达量高于阴性对照组，差异有统计学意义（P<0.01）。综上所述，半枝莲多糖能抑制胃癌细胞SCG-7901的增殖，其机制可能与上调P53基因表达有关。

参考文献

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[2]牛国晓，李洁.半枝莲抗肿瘤机制研究进展[J].肿瘤防治研究，2012，39（2）：231-233.

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[5] Nanda T.The Influence of Environmental and Genetic Factors on Various Disorders and Diseases[J].Journal of Antivirals & Antiretrovirals，2011.

[6]韩澄，聂少平，黄丹菲，等.青钱柳多糖对人胃癌MGC_803细胞生长的影响[J].天然产物研究与开发，2009，21（6）：952-955.

[7]吉爱军，陆建伟，李苏平，等.树舌多糖对人胃癌SGC-7901细胞增殖及CyclinD1、p16表达的影响[J].中国肿瘤外科杂志，2015，7（6）：356-359.

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